荔枝核有效部位群對實驗性非酒精性脂肪肝的治療作用及機制

黃玉影，李常青，陳斯泰，黃志剛，郭潔文，李小翚，屈喜玲

（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州　510006；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州　510405；3.惠州市九惠制藥股份有限公司，廣東惠州516007；4.廣州市中醫醫院，廣東廣州510130）

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荔枝核有效部位群對實驗性非酒精性脂肪肝的治療作用及機制

黃玉影1，李常青2，陳斯泰2，黃志剛3，郭潔文4，李小翚1，屈喜玲3

（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405；3.惠州市九惠制藥股份有限公司，廣東惠州516007；4.廣州市中醫醫院，廣東廣州510130）

摘要：【目的】觀察荔枝核有效部位群（SLEC）對大鼠非酒精性脂肪肝（NAFLD）的治療作用，并探討其作用機制。【方法】選用SPF級大鼠，雌雄各半，采用高脂飼料加高脂乳液灌胃8周復制NAFLD模型，造模成功后將造模組大鼠根據體質量和血糖值隨機分為模型組、SLEC低劑量組（劑量為0.74 g·kg-1·d-1）、SLEC高劑量組（劑量為1.48 g·kg-1·d-1）和二甲雙胍組（劑量為100 mg·kg-1·d-1），每組8只，雌雄各半，并設正常組為對照。給藥4周后，腹主動脈采血、取肝組織。采用全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、空腹血糖（FBG）；采用比色法檢測血清游離脂肪酸（NEFA）、放射免疫法檢測血清胰島素（Ins）含量，計算穩態模型胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、胰島素敏感性指數（ISI）；采用甘油磷酸氧化酶—過氧化物酶偶聯（GPO-PAP）法、膽固醇氧化酶—過氧化物酶偶聯（COD-PAP）法、水溶性四氮唑（WST-1）法、硫代巴比妥酸（TBA）法分別檢測肝組織TG、CHOL、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；觀察大鼠肝臟組織病理變化，采用實時熒光定量PCR 和Western-blot法分別檢測大鼠肝組織固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA和蛋白的表達?！窘Y果】SLEC高劑量組能顯著降低NAFLD大鼠血清TG、LDL-C、NEFA和肝脂質含量，提高大鼠血清SOD含量，明顯改善大鼠HOMA-IR、提高ISI，與模型組比較差異均有統計學意義（P<0.05），且SLEC高劑量組改善肝細胞脂質沉積作用明顯。與模型組比較，SLEC高、低劑量均能顯著降低大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白表達（P<0.05）?！窘Y論】SLEC對NAFLD大鼠肝細胞脂質沉積的病理狀況具有明顯改善作用，作用機制與調節脂質代謝、降低NEFA水平，改善IR、抗氧化應激和下調SREBP-1c基因與蛋白表達有關。

關鍵詞：荔枝核有效部位群/藥理學；非酒精性脂肪肝/中藥療法；胰島素抵抗；肝/病理學；基因表達調控；疾病模型，動物；大鼠

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）有關、以彌漫性肝細胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征，與肝硬化和肝細胞癌的發生密切相關［1］。NAFLD在我國發病增長迅速，成人患病率在15%左右［1］。荔枝核系無患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn.的干燥成熟種子。研究表明荔枝核能提高胰島素敏感性，調整高脂血癥—脂肪肝所致的糖脂代謝紊亂［2-3］?？傇碥?、黃酮和鞣質均是荔枝核發揮降糖調脂、改善IR作用的有效部位［4-6］。研究［7］顯示，由荔枝核總皂苷、黃酮和鞣質組成的有效部位群（Semen Litchi effective constituents，SLEC），對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗具有顯著的改善作用。本研究采用高脂飼料加高脂乳液建立的大鼠NAFLD-IR模型，進一步評價SLEC的藥效作用，并探討其作用機制，現報道如下。

1　材料與方法

1.1動物、飼料及高脂乳液SPF級SD大鼠90只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2013-0002。高脂飼料（質量分數）：73.8%基礎飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、5%蔗糖、0.2%膽鹽，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）2013-0002。高脂乳液自制，每100 mL含豬油20 g、花生油30 g、膽固醇15 g、豬膽鹽3 g、吐溫-80 5 mL、丙二醇5 mL、雙蒸水適量?；A鼠料：SPF級包裝，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2藥物荔枝核藥材購于廣州市藥材公司（批號：YPA3C001），經廣東省生物制品與藥物研究所鐘世順副主任藥師鑒定為無患子科植物荔枝（Litchi chinensis Sonn.）的干燥成熟種子；荔枝核有效部位群提取方法參照文獻［7］，提取物為粉末，使用前用雙蒸水配成混懸液（SLEC低劑量0.074 g/mL，SLEC高劑量0.148 g/mL）；鹽酸二甲雙胍片（0.5 g/片，批號：1409082）由中美上海施貴寶制藥有限公司生產，研磨后用雙蒸水配成溶液（10 mg/mL）。

1.3主要試劑及儀器甘油三酯測試盒（批號：140761）、膽固醇測試盒（批號：141151）、谷丙轉氨酶測試盒（批號：140611）和谷草轉氨酶測試盒（批號：140561）均由中生北控生物科技有限公司生產；高密度脂蛋白膽固醇測試盒（批號：806RCL）和低密度脂蛋白膽固醇測試盒（批號：810RLK）均由日本積水株式會社生產；葡萄糖測試盒（批號：20141022）由上海科華生物工程股份有限公司生產；甘油三酯測試盒（用于測定肝脂質，批號：20150423）、膽固醇測試盒（用于測定肝脂質，批號：20150325）、游離脂肪酸測試盒（批號：20150326）、總超氧化物歧化酶測試盒（批號：20150407）、丙二醛測試盒（批號：20150324）和總蛋白定量測試盒（批號：20150407）均由南京建成生物工程研究所生產；碘［125I］胰島素放射免疫分析盒（批號：20150502）由北京北方生物技術研究所生產；SYBR Green qPCR SuperMix（批號：C11744500）由美國Invitrogen公司生產；SREBP-1c兔多克隆一抗（批號：YT5508）由美國Immunoway公司生產，相應二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、Mouse/Human ads-HRP（批號：4050-05）由美國Southern biotech公司生產；辣根過氧化物酶（HRP）標記的GAPDH內參（批號：KC-5G5）由上海康成生物工程有限公司生產；豬膽鹽（批號：3202090）、膽固醇（批號：2102013）由廣東環凱微生物科技有限公司生產；吐溫-80、丙二醇均為食品級，購于廣州東征化玻儀器有限公司；卓越金瑞血糖試紙（批號：473282）由德國羅氏診斷有限公司生產。AU5421全自動生化分析儀（日本Olympus光學株式會社）；XDS-2倒置顯微鏡（中國廣州光學儀器廠）；ABIPRISMR7500 Sequence Detection System（美國ABI公司）；EnSpireRMultimode Plate Reader 2000（美國Perkin Elmer公司）；Accu-ChekRPerforma卓越型血糖儀（德國Roche公司）。

1.4造模方法［8］90只SPF級SD大鼠飼養于廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2013-0001，適應性飼養7 d后根據體質量隨機分為2組，正常對照組8只、造模組82只，每組雌雄各半，分籠飼養，每周稱量體質量1次。正常對照組用基礎鼠料喂養，造模組用高脂飼料喂養的同時，按以下順序灌胃相應體積的高脂乳液：第1周2.5 mL/kg、第2周5.0 mL/kg、第3周7.5 mL/kg、第4～8周10 mL/kg，以50 mL/kg為上限。造模持續8周，2組均給予自由飲水及相應飲食。8周后，禁食不禁水16 h，用血糖儀測定大鼠尾部末端血糖后，立即灌以10 mL/kg的0.2 g/mL葡萄糖溶液，然后測定120 min時的血糖值，檢測糖耐量。從造模組中隨機抽取雌雄大鼠各1只，用0.2 g/L戊巴比妥鈉以2.0 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后觀察肝臟病變情況確認造模成功［8］。

1.5動物分組及給藥取造模組存在糖調節受損（空腹血糖≥6.1 mmol/L，或餐后2 h血糖≥7.8 mmol/L）［9］的32只大鼠，根據體質量和血糖值隨機分成模型組、SLEC低劑量組（劑量為0.74 g·kg-1· d-）1、SLEC高劑量組（劑量為1.48 g·kg-1·d-1）和二甲雙胍組（劑量為100 mg·kg-1·d-）1，每組8只，雌雄各半。正常組和模型組每日灌胃10 mL/kg雙蒸水，其他組分別灌胃10 mL/kg的相應藥物。全部大鼠給予普通鼠料和正常飲水。4周后，禁食不禁水16 h，用0.2 g/L戊巴比妥鈉以2 mL/kg腹腔注射麻醉，用真空采血管從腹主動脈采血，取肝稱質量，迅速切取肝組織放于凍存管、置于液氮中備用，切取肝右葉組織放于體積分數為10%的中性福爾馬林中固定、送檢，切取肝組織放于離心管中置-20℃冰箱備用。

1.6檢測指標及方法

1.6.1血脂、血糖及肝功能采血后靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，采用全自動生化分析儀檢測血清中的甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）含量。

1.6.2血清胰島素（Ins）含量采用放射免疫法測定，并用HOMA穩態模型計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、胰島素敏感指數（ISI）。計算公式［8］：HOMA-IR = FBG×Ins/22.5，ISI = 1/（FBG×Ins）。

1.6.3血清游離脂肪酸（NEFA）含量采用比色法測定。

1.6.4肝脂質含量稱取0.2 g肝組織，加入9倍體積的無水乙醇（分析純），用電動勻漿器制成100 g/L肝勻漿，根據試劑盒說明書分別用甘油磷酸氧化酶—過氧化物酶偶聯（GPO-PAP）法、膽固醇氧化酶—過氧化物酶偶聯（COD-PAP）法測定100 g/L肝勻漿中TG、CHOL的含量。

1.6.5肝組織總超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量稱取0.2 g肝組織，加入9倍體積的生理鹽水，用電動勻漿器制成100 g/L肝勻漿，根據試劑盒說明書分別用水溶性四氮唑（WST-1）法、硫代巴比妥酸（TBA）法測定100 g/L肝勻漿中的SOD、MDA含量。

1.6.6肝組織病理學取體積分數為10%的中性福爾馬林固定后的肝組織，常規石蠟包埋、切片和蘇木素—伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織病理改變；取冷凍肝組織切片，油紅O染色，光鏡下觀察肝臟脂肪病變情況。

1.6.7肝組織固醇調節元件結合蛋白-1c（SREBP-1c）mRNA及蛋白的表達各組隨機抽取4只大鼠，取肝組織，分別用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法和蛋白質印跡法（Western-blot）檢測SREBP-1c mRNA和蛋白的表達水平。

1.6.7.1 SREBP-1c mRNA檢測引物由廣州萊德爾生物科技有限公司合成。檢測序列片段大?。簝葏⑵桅?actin 150 bp、目的片段SREBP-1c 184 bp。以Trizol法提取大鼠肝組織總RNA，Dnase I （Rnase Free）去除基因組DNA，分別測定260、280 nm處吸光度（D）值，并計算其比值，D260/D280比值均大于1.8。每樣本取1 μL RNA進行逆轉錄反應（合成cDNA），按說明書操作步驟進行。以cDNA為模板的熒光定量PCR檢測按20 μL體系，SREBP-1c樣本引物序列：SREBP-1c-F：5’-GTAGAGCACATTCCCCAAGT-3’，SREBP-1c-R：5’-CAGTTGATGTAGAGGCTAAGCT-3’，β-actin-F：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，β-actin-R：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’，以18sr RNA為內參。反應體系內含cDNA模板5.0 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，dH2O 4.0 μL；95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸32 s，共40個循環。熔解曲線分析：溫度60℃～95℃。利用ABI公司自帶的PCR系統軟件分析，觀察擴增曲線，計算樣本歸一化的每個反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數（Ct值）、目的基因Ct值與內參Ct值之差△Ct、各組△Ct與正常對照組△Ct之差得△△Ct，以△△Ct值的負數為指數計算2-△△Ct，并進行比較。

1.6.7.2 SREBP-1c蛋白表達檢測采用無線電免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解大鼠肝組織，提取各組蛋白；二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量，按照總蛋白濃度一致進行聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳，用濕轉方法轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；以50 g/L的脫脂奶粉室溫閉液1 h，分別加入一抗（SREBP-1c兔多抗，稀釋倍數1∶500），4℃孵育過夜；加辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗羊抗兔多抗（Goat Anti-Rabbit IgG，稀釋倍數1∶20 000），室溫1 h；徹底洗膜后進行化學發光，最后進行顯影、定影。使用IPWIN60圖像分析軟件對條帶灰度進行分析，計算目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度的比值（p）作為SREBP-1C蛋白表達的相對值。

1.7統計方法采用SPSS 10.0對各實驗組數據進行單因素方差分析，方差齊時采用LSD法檢驗，方差不齊時進行個案排秩后再使用LSD檢驗法分析。各組數據均以均數±標準差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠一般情況的觀察正常組大鼠毛發整潔光澤，行動靈活，飲食飲水正常，排泄物正常，體質量持續穩定增長。造模組大鼠毛發稍欠整潔光澤，較不喜活動，飲食飲水正常，排泄物油膩，體質量增長比正常組多。雌鼠較雄鼠飲食飲水量少且活潑好動。更換飼料及撤除高脂乳液灌胃后給藥期間，模型組及各給藥組大鼠毛發較造模期間整潔、活動稍增多，各給藥組大鼠排泄物較正常。

2.2造模8周后大鼠情況造模8周后，隨機抽取的造模組大鼠肝臟表面呈油膩黃色狀，各肝葉邊緣較鈍，肝臟脂質沉積明顯，顯示脂肪肝模型已建立。大鼠尾部末梢血糖檢測結果顯示：正常組大鼠空腹血糖為（5.19±0.46）mmol/L（極小值為4.6，極大值為5.8），餐后2 h血糖為（5.81±0.80）mmol/L（極小值為4.4，極大值為6.8）。造模組共有32只大鼠空腹血糖≥6.1 mmol/L或/和2 h血糖≥7.8 mmol/L，為造模組大鼠總數的39%。結果表明32只大鼠存在較明顯的糖調節受損，此為胰島素抵抗表現之一，提示NAFLD-IR大鼠模型成立。

2.3各組大鼠血脂、血清NEFA含量比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TG、LDL-C、NEFA水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高劑量組血清TG、LDL-C、NEFA水平均顯著降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠血脂、血清NEFA的比較Table 1 Comparison of blood lipids and serum NEFA level of rats in different groups?。ā纒）

表1　各組大鼠血脂、血清NEFA的比較Table 1 Comparison of blood lipids and serum NEFA level of rats in different groups　（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 cTG/（mmol·L-1）0.61±0.16 0.92±0.33①0.47±0.14②0.88±0.44 0.71±0.11 cCHOL/（mmol·L-1）1.54±0.27 1.78±0.39 1.61±0.53 1.66±0.27 1.55±0.50 cLDL-C/（mmol·L-1）0.18±0.03 0.26±0.10①0.18±0.03②0.22±0.04 0.18±0.02②cHDL-C/（mmol·L-1）0.62±0.11 0.58±0.10 0.55±0.10 0.55±0.14 0.51±0.11 cNEFA/（μmol·L-1）423.29±45.65 570.91±81.92①487.43±53.32②504.25±81.40 489.27±67.26②

2.4各組大鼠肝功能比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠ALT、AST含量差異均無統計學意義（P＞0.05），說明造模大鼠沒有肝損傷發生。與模型組比較，SLEC高、低劑量組ALT、AST含量差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.5各組大鼠胰島素抵抗程度比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠HOMA-IR顯著升高（P＜0.05），ISI顯著降低（P＜0.05），提示模型組大鼠存在明顯的胰島素抵抗和胰島素敏感性降低。與模型組比較，SLEC高、低劑量組大鼠HOMAIR均顯著降低（P＜0.05），SLEC高劑量組ISI顯著升高（P＜0.05），提示SLEC高劑量組具有明顯的改善胰島素抵抗和提高胰島素敏感性作用。

2.6各組大鼠肝脂質及肝臟氧化應激程度比較

表4結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TG、CHOL含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高劑量組大鼠肝組織中的TG含量顯著降低（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠肝組織的SOD含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高劑量組SOD含量顯著升高（P＜0.05）。各組大鼠的MDA含量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2　各組大鼠肝功能的比較Table 2 Comparison of liver function of rats in different groups?。邸纒，J/（U·L-1）］

表2　各組大鼠肝功能的比較Table 2 Comparison of liver function of rats in different groups?。邸纒，J/（U·L-1）］

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 ALT 24.88±4.16 28.88±5.87 24.12±5.51 28.00±8.04 22.38±6.84 AST 165.70±21.95 168.12±15.28 146.88±17.54 159.25±28.35 112.62±21.65①②

表3　各組大鼠胰島素抵抗程度的比較Table 3 Comparison of insulin resistance of rats in different groups?。ā纒）

表3　各組大鼠胰島素抵抗程度的比較Table 3 Comparison of insulin resistance of rats in different groups　（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 cFBG/（mmol·L-1）6.65±1.24 7.17±1.11 6.36±1.12 6.28±0.91 6.84±0.64 JIns/（mU·L-1）56.48±6.69 70.64±7.78 59.07±7.78 66.40±15.87 61.72±11.30 HOMA-IR 16.68±3.81 22.38±3.28①16.64±3.26②18.38±5.01②18.75±3 .95 ISI（×10-3）2.78±0.62 2.02±0.31①2.78±0.64②2.54±0.54 2.46±0.52

表4　各組大鼠肝脂質及氧化應激程度的比較Table 4 Comparison of liver lipids and oxidative stress of rats in different groups　（±s）

表4　各組大鼠肝脂質及氧化應激程度的比較Table 4 Comparison of liver lipids and oxidative stress of rats in different groups?。ā纒）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N88888 cTG/（mmol·L-1）1.01±0.14 1.76±0.26①1.39±0.42②1.52±0.45 1.32±0.37②cCHOL/（mmol·L-1）0.85±0.08 1.25±0.27①1.14±0.33 1.16±0.24 1.12±0.25 JSOD/（U·mg-1）752.40±67.89 642.06±78.23①814.38±167.75②708.80±94.88 676.13±116.04 bMDA/（nmol·mg-1）1.06±0.12 1.34±0.27 1.03±0.18 1.14±0.16 1.16±0.39

2.7各組大鼠肝組織切片HE染色及油紅O染色病理觀察圖1結果顯示：正常組大鼠肝細胞大小相仿、形態相似、細胞核清晰且位于細胞中央；模型組大鼠肝細胞內彌漫性脂肪變性明顯，細胞大小不均，脂肪變性使細胞核移位；各給藥組脂肪變性顯著減少，細胞形態較均勻。圖2結果顯示：正常組大鼠肝細胞未見明顯紅色脂泡出現；模型組大鼠肝細胞內紅色脂泡廣泛分布，說明細胞內存在大量脂質；各給藥組肝細胞內紅色脂泡均顯著減少，表明SLEC能在一定程度上改善肝脂質沉積的病理狀態。

圖1　各組大鼠肝臟組織病理狀態比較（HE染色，×250）Figure 1 Comparison of liver pathologic feature of rats in different groups（by HE staining，×250）

圖2　各組大鼠肝臟組織病理變化比較（油紅O染色，×250）Figure 2 Comparison of liver pathologic feature of rats in different groups（by Oil Red O staining，×250）

2.8各組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白的表達比較表5、圖3結果顯示：與正常組大鼠比較，模型組大鼠肝組織的SREBP-1c mRNA及蛋白的表達量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SLEC高、低劑量組大鼠肝組織的SREBP-1c mRNA及蛋白的表達量均顯著降低（P＜0.05）。

3　討論

研究表明：幾乎所有的NAFLD患者都存在肝臟和周圍組織的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［10］。NAFLD病理機制主要是指肥胖、高脂血癥等因素導致IR產生及肝細胞脂肪變性［1］。NAFLD患者由于存在IR，肝臟和脂肪組織等胰島素敏感性降低使脂肪分解增加，血中NEFA含量增加，進而導致肝臟NEFA攝取增加，肝內TG從頭合成增加，導致了TG在肝臟的聚積［11］。

表5　各組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白相對表達量的比較Table 5　Comparison of relative expression values of SREBP-1c mRNA and protein in rats of different groups?。ā纒）

表5　各組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA及蛋白相對表達量的比較Table 5　Comparison of relative expression values of SREBP-1c mRNA and protein in rats of different groups?。ā纒）

組別正常組模型組SLEC高劑量組SLEC低劑量組二甲雙胍組N44444 1.31±0.79 4.69±3.00①1.66±1.40②1.92±1.55②0.88±0.65②p 0.120±0.002 0.240±0.002①0.058±0.002②0.225±0.002②0.169±0.004②n2-ΔΔCt

圖3　各組大鼠SREBP-1c蛋白表達凝膠電泳圖Figure 3 Gel electrophoresis results of SREBP-1c protein expression of rats in different groups

隨著肝臟攝取NEFA的增多，肝細胞發生脂肪變性后產生過量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），超出機體抗氧化系統清除能力，導致氧化應激（oxidative stress，OS）及過氧化產物產生［12］。氧化應激可以進一步誘發內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）反應，它可以啟動固醇調節級聯反應，激活固醇調節元件結合蛋白（sterolregulatory element binding proteins，SREBPs），使SREBPs與SREBPs裂解激活蛋白形成復合物后經酶解作用成為轉錄因子，進入細胞核與脂肪酸、膽固醇等靶向因子結合，使脂肪酸合成大量增加，造成肝細胞脂肪代謝紊亂［12］。

SREBP-1c屬于SREBPs家族成員，對脂肪合成酶的編碼基因表達具有正向調控作用，其表達升高可導致肝細胞的脂肪酸合成增加［13-15］。SREBP-1c還可通過抑制極低密度脂蛋白（VLDL）的組裝使肝臟TG排出減少造成脂質聚積。因此，SREBP-1c是機體脂質代謝中的關鍵調控靶點［16］。

荔枝核性味甘、溫，微苦澀，入肝腎，具有溫中、理氣、止痛的功效。研究顯示荔枝改善糖脂質代謝和逆轉IR作用明顯，荔枝核有效部位群含皂苷、黃酮和鞣質，是荔枝核發揮調脂降糖活性的主要有效部位［2，4，7］。

本研究結果顯示：模型組大鼠血清TG、LDLC、NEFA含量及肝脂質含量較正常組均顯著升高（P＜0.05）；病理組織觀察顯示肝細胞脂肪變性明顯，且模型組大鼠HOMA-IR顯著升高（P＜0.05）、ISI顯著降低（P＜0.05），表明高脂飼料喂養加高脂乳液灌胃建立的NAFLD-IR大鼠模型成立，但模型組大鼠血清ALT和AST含量均在正常范圍，且與正常組比較差異均無統計學意義（P＞0.05），表明造模大鼠主要以肝臟脂質沉積為主，沒有明顯的非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）發生。經SLEC治療后，SLEC高劑量組能顯著降低NAFLD-IR大鼠血清TG、LDL-C、NEFA水平，減輕肝脂質沉積，降低HOMA-IR、提高ISI以及血清SOD含量，且SLEC高、低劑量組SREBP-1c mRNA及蛋白相對表達水平均顯著低于模型組（P＜0.05），提示SLEC抗NAFLD脂質沉積的作用機制，與調節脂質代謝、降低NEFA水平，改善IR、抗氧化應激和下調SREBP-1c基因與蛋白表達有關。

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【責任編輯：黃玲】

Therapeutic Effect of Semen Litchi Effective Constituents for Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Rats and Its Mechanism

HUANG Yuying1，LI Changqing2，CHEN Sitai2，HUANG Zhigang3，GUO Jiewen4，LI Xiaohui1，QU Xiling3
（1.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Tropical Medicine Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；3.Huizhou Jiuhui Pharmaceutical Co.，Ltd，Huizhou 516007 Guangdong，China；4.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130 Guangdong，China）

Abstract：Objective To observe the therapeutic effect of Semen Litchi effective constituents（SLEC）for rats with nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）and to explore its mechanism.Methods SPF rats，male in half，were fed with high fat diet for 8 weeks to induce NAFLD model.And then the modeled rats were randomly divided into 4 groups according to body mass and blood glucose level，namely model group，low-dose SLEC group （0.74 g·kg-1·d-1），high-dose LSEC group（1.48 g·kg-1·d-1），and metformin group（100 mg·kg-1·d-1），8 rats in each group，male in half.A normal group was also set up.After medication for 4 weeks，blood was sampled from the abdominal aorta，and liver tissues were taken out for the test.The serum levels of triglyceride（TG），cholesterol（CHOL），high- density lipoprotein cholesterol（HDL-C），low- density lipoprotein cholesterol（LDL-C），alanine aminotransferase（ALT），aspartase aminotransferase（AST）and fasting blood-glucose（FBG）were detected by automatic biochemical analyzer．Serum content of non-esterified fatty acid（NEFA）was detected by colorimetry，and serum insulin content was detected by radioimmunoassay（RIA）.Homeostasis model of assessment for insulin resistence index（HOMA-IR）and insulin sensitivity index（ISI）were calculated.The content of TG，CHOL，superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）in liver tissues were detected respectively by glycerol phosphate oxidase-peroxidase（GPO-PAP），cholesterol oxidase - peroxidase（COD-PAP），water-soluble tetrazolium（WST-1），thiobarbituric acid（TBA）methods.Pathological changes of liver tissues were observed.The sterol-regulatory element binding protein-1c（SREBP-1c）mRNA expression level in liver tissues was detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR），and the hepatic SREBP-1c protein expression was detected by Western blot.Results Compared with the model group，TG，LDL-C，NEFA and liver lipids contents in high-dose SLEC group were decreased，SOD was increased，HOMA-IR was improved，and ISI was enhanced，the difference being significant（P＜0.05），and the degree of hepatic steatosis was alleviated obviously，too.Compared with the model group，the mRNA and protein expression levels of SREBP-1c in high- and low-dose SLEC groups were obviously down-regulated（P＜0.05）.Conclusion SLEC show obvious therapeutic effect on hepatic steatosis in NAFLD rats，which might be related to regulating lipid metabolism，decreasing NEFA level，improving IR and oxidative stress，and down -regulating SREBP -1c mRNA and protein expression．

Key words：Semen Litchi effective constituents/pharmacology；non-alcoholic fatty liver disease/TCD therapy；insulin resistance；liver/pathology；gene expression regulation；disease models，animal；rats

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0346 - 07

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．016

收稿日期：2015-09-03

作者簡介：黃玉影（1991-），女，碩士研究生；E-mail：Cheryl-hyy@qq.com

通訊作者：李小翚，女，副教授；E-mail：546647632@qq.com

基金項目：廣東省重大科技專項（編號：2012A080202010）；廣東省自然科學基金資助項目（編號：S2013010012998）；廣州市科技計劃應用研究基礎專項（編號：2013J4100088）；廣東省中醫藥局基金項目（編號：20122004）