培土生金法對慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌細胞增殖與凋亡的影響

宋璟，孫志佳

（廣州中醫藥大學，廣東廣州　510405）

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培土生金法對慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌細胞增殖與凋亡的影響

宋璟，孫志佳

（廣州中醫藥大學，廣東廣州510405）

摘要：【目的】觀察培土生金法（加味陳夏六君子湯）對慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠膈肌細胞增殖與凋亡的影響。【方法】將40只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥高劑量組（71.82 g·kg-1·d-1）、中藥低劑量組（17.96 g·kg-1·d-1），采用氣管內注入脂多糖（LPS）聯合香煙煙熏法造模，觀察各組大鼠一般情況及體質量變化；蘇木素—伊紅（HE）染色鏡下觀察大鼠膈肌病理變化，免疫組織化學法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）在膈肌中的表達，并計算增殖指數（PI）。TUNEL法檢測膈肌細胞凋亡情況，并計算凋亡指數（AI）及PI/AI值。【結果】與空白組比較，模型組大鼠體質量增長緩慢（P＜0.01），膈肌細胞凋亡指數顯著升高（P＜0.01），PI/AI值顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高劑量組大鼠體質量增長迅速（P＜0.01），細胞凋亡指數顯著降低（P＜0.01），PI/AI值顯著升高（P＜0.01）。【結論】培土生金法治療COPD的作用與其能維持細胞增殖/凋亡平衡，減少COPD大鼠膈肌細胞凋亡有關。

關鍵詞：培土生金；陳夏六君子湯；慢性阻塞性肺疾病/中藥療法；膈肌/病理學；細胞凋亡；疾病模型，動物；大鼠

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以氣流受限不完全可逆為特征的疾病，是老年常見病、多發病，主要表現為慢性咳嗽、咳痰、喘息胸悶等癥狀，同時也是一種全身性疾病。COPD患者由于肺結構的破壞，呼吸負荷加重，長期或反復處于肺氣腫，缺氧，酸中毒，炎癥刺激，營養障礙等狀態，導致呼吸肌營養不良、功能減退，甚至出現萎縮。膈肌作為呼吸肌的重要組成部分，容易出現膈肌疲勞，直接影響著患者的呼吸運動、氣體交換等功能，參與到COPD發展為呼吸衰竭的過程。膈肌疲勞是導致呼吸衰竭的重要病機之一［1］。培土生金法是中醫傳統治法，具有補脾益肺的作用。臨床觀察發現培土生金法能改善COPD穩定期患者營養狀態，減輕慢性缺氧和二氧化碳潴留，緩解膈肌疲勞，延緩肺功能進行性下降，提高生活質量［2-5］。為進一步證實培土生金法對COPD膈肌的影響，本研究從膈肌細胞增殖和凋亡角度探討培土生金法改善COPD膈肌疲勞的作用機制，現報道如下。

1　材料與方法

1.1藥物本研究采用培土生金法代表方六君子湯加減，具體方藥：法半夏10 g、陳皮5 g、黨參30 g、白術15 g、茯苓15 g、甘草6 g、紫蘇子15 g、紫蘇葉15 g、五爪龍30 g、毛冬青20 g、百合10 g。藥物來自于廣州中醫藥大學第一附屬醫院。

1.2動物SPF級Wistar大鼠，體質量約200 g/只，共40只，雌雄各半，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2013-0034，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2013-0092，合格證編號：44005800000260。

1.3主要試劑與儀器脂多糖（LPS，美國Sigma公司）；椰樹香煙（廣東中煙工業有限公司生產，焦油量11 mg/支）；TUNEL原位凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；增殖細胞核抗原（PCNA）一抗、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）；二抗（美國Bioworld公司）。YD-129智能生物組織脫水機、YD-6L石蠟包埋冷凍機、YD-AB石蠟切片機、YD-315攤片烤片機（金華益迪醫療設備有限公司）；FBX50FF電子顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4分組及COPD大鼠模型的復制［6］造模期共42 d，根據大鼠性別、體質量隨機分為4組，即空白組、COPD模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組10只大鼠，雌雄各半。COPD模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組分別于第1天、第14天大鼠氣管內注入脂多糖溶液，具體方法：用50 mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠于固定板，暴露聲門；灌胃針快速插入氣管，注射生理鹽水稀釋后（1 mg/mL）的LPS 200 μL，然后將大鼠用固定板直立旋轉，使LPS液能夠均勻分布于兩肺。在第2～42天（第14天除外）將造模大鼠置于100 cm×50 cm×50 cm自制染毒箱內被動熏香煙，1次/d，0.5 h/次。

1.5給藥中藥組均于造模第2天開始灌胃中藥，中藥高劑量組、中藥低劑量組分別按成人臨床用藥的4倍、1倍換算，給藥劑量分別為71.82、17.96 g·kg-1·d-1，每日1次。空白組和模型組灌胃生理鹽水。灌胃時間與造模相隔至少4 h。

1.6觀察大鼠一般情況觀察大鼠的精神狀況、活動度、飲食量、排泄物、毛發光澤度、口鼻分泌物、氣喘等情況。

1.7取材腹主動脈放血處死大鼠，剖取膈肌，經40 g/L多聚甲醛固定后，梯度酒精脫水，石蠟包埋。

1.8蘇木素—伊紅（HE）染色膈肌組織蠟塊4 μm連續切片、編號，常規脫蠟至水經HE染色、脫水、透明、封片后，鏡下觀察膈肌組織結構特點和改變。

1.9免疫組織化學法檢測膈肌PCNA的表達4 μm膈肌組織石蠟切片常規脫蠟至水，滅活內源性氧化物酶，抗原熱修復，按步驟加入一抗、二抗，DAB避光顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。細胞核內出現棕色或棕褐色顆粒為PCNA表達陽性。顯微鏡下隨機選取多個視野，計數細胞中的PCNA陽性細胞數，計算膈肌細胞增殖率（PI）：pPI= n增殖細胞數/ n細胞總數×100%。

1.10末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）檢測膈肌細胞凋亡4 μm膈肌石蠟切片常規脫蠟至水，體積分數3%H2O2浸泡，蛋白酶K 37℃消化，滴加TUNEL混合液，DAB+H2O2顯色，蘇木素復染，水洗藍化，封片。正常膈肌細胞核被蘇木素染成藍紫色，TUNEL陽性染色定位于細胞核內，凋亡陽性細胞核被染為棕黃色。顯微鏡下隨機選取多個視野，計數凋亡細胞數，計算膈肌細胞凋亡率（AI）：pAI= n凋亡細胞數/ n細胞總數×100%。

1.11統計方法實驗數據采用SPSS 16.0進行統計學分析，數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊選用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane’s T2進行檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠一般情況整個造模期空白組大鼠反應機敏，活潑好動，毛色光澤，呼吸平穩，飲食量無改變。COPD組大鼠初期造模過程中出現驚嚇亂竄，咳嗽，中后期造模過程中和不吸煙情況下均出現閉目懶動，反應遲緩，咳嗽較頻，毛色灰黃無光澤，時有洗臉樣動作，飲食量減少。

2.2各組膈肌病理結構改變圖1結果顯示：空白組膈肌纖維排列緊密、整齊、完整，無明顯損傷；COPD模型組及中藥組均出現不同程度的膈肌纖維排列紊亂、間隙增寬。其中中藥高劑量組上述表現較輕微，模型組與中藥低劑量組表現更為明顯，并出現部分膈肌纖維斷裂、溶解，膈肌損傷較為嚴重。

圖1　各組大鼠膈肌組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Pathological features of rat diaphragm of various groups（by HE，×200）

2.3各組對COPD大鼠體質量的影響表1結果顯示：造模前各組大鼠體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；造模后，模型組體質量顯著低于空白組，中藥高劑量可顯著升高大鼠體質量，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

2.4各組對COPD大鼠膈肌細胞凋亡的影響圖2、表2結果顯示：膈肌組織中，凋亡細胞細胞核呈棕黃色，正常細胞細胞核呈藍紫色。模型組膈肌細胞AI較空白組顯著升高，中藥高劑量組可顯著降低AI值，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

表1　各組對COPD大鼠體質量的影響Table 1 Comparison of rat body weight in various groups　（±s，m/g）

表1　各組對COPD大鼠體質量的影響Table 1 Comparison of rat body weight in various groups　（±s，m/g）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別空白組COPD模型組中藥高劑量組中藥低劑量組N 10 10 10 10造模前210.23±8.56 207.93±9.01 209.86±7.53 210.36±9.68造模后429.17±20.19 335.02±20.73①378.24±24.30②345.98±20.82

圖2　各組大鼠膈肌細胞凋亡結果比較（TUNEL檢測，×200）Figure 2 Apoptosis of diaphragm muscle cells of various groups（by TUNEL，×200）

2.5各組對COPD大鼠膈肌細胞增殖的影響表3結果顯示：與空白組比較，模型組膈肌細胞增殖指數增多（P＜0.05），但中藥高、低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。膈肌細胞增殖指數/凋亡指數（PI/AI）數據統計顯示：與空白組比較，中藥高劑量組基本上保持膈肌細胞增殖與凋亡過程的平衡，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組PI/AI值顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。中藥低劑量組PI/AI與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明模型組和中藥低劑量組COPD發病過程中，雖然有膈肌細胞增殖，但以膈肌細胞凋亡占主導地位。

表2　各組對COPD大鼠膈肌細胞凋亡指數的影響Table 2　Comparison of AI of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

表2　各組對COPD大鼠膈肌細胞凋亡指數的影響Table 2　Comparison of AI of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組N 10 10 10 10 pAI/% 12.41±4.16 49.71±10.43①29.48±6.83②45.79±6.69

表3　各組對COPD大鼠膈肌細胞增殖的影響Table 3 Comparison of proliferation of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

表3　各組對COPD大鼠膈肌細胞增殖的影響Table 3 Comparison of proliferation of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組N pPI/AI10 10 10 10 pPI/% 13.21±3.74 22.67±6.87①25.89±4.91 21.75±5.97 1.09±0.25 0.45±0.11②0.89±0.12③0.49±0.17

3　討論

呼吸衰竭作為COPD常見并發癥與膈肌疲勞關系密切。膈肌疲勞作為COPD發展過程中的重要環節，直接影響COPD的預后及轉歸［7］。有學者認為膈肌疲勞伴隨著膈肌纖維形態學改變，與膈肌細胞增殖/凋亡平衡失調、肌纖維蛋白降解/合成失衡、氧化/抗氧化系統失衡有關［8］。本研究結果顯示：COPD大鼠體質量增長緩慢，膈肌細胞同時存在增殖和凋亡，但增殖與凋亡比例失衡，以細胞凋亡為主要過程，提示膈肌細胞過度凋亡參與COPD的病理過程。COPD引起膈肌細胞凋亡的確切機制尚不清楚，推測可能與以下因素有關：①吸煙可產生大量氧自由基，氧自由基及其衍生物與細胞凋亡密切相關，其通過脂質過氧化物激活多種細胞凋亡途徑引起細胞凋亡；②感染是COPD加重機制之一，炎癥反應產生炎癥介質、細胞因子等聚集膈肌，直接導致膈肌細胞損傷，或通過調控凋亡基因的表達間接開啟凋亡途徑促進細胞凋亡；③COPD多伴隨食欲減退、營養障礙、微量元素比例失調，最終影響膈肌結構和功能異常。確切機制有待進一步研究。

PCNA名為增殖細胞核抗原，在細胞周期S期中顯著表達，參與DNA的合成，與細胞增殖密切相關。PCNA作為細胞增殖情況的評價指標，可反映細胞增殖及修復能力［9］。本研究結果顯示：COPD模型組大鼠不僅存在膈肌細胞凋亡，同時發生大量膈肌細胞的增殖，而正常動物僅存在少量細胞凋亡和增殖。推斷活躍的細胞增殖可反映劇烈細胞凋亡損傷后的修復能力。正常生理過程中，有損傷就會有修復，增殖與凋亡比例保持動態平衡，從而維護正常的新陳代謝，保持器官功能的完整協調。一旦細胞凋亡增加的比例高于細胞增殖，細胞凋亡占主導地位，則導致機體組織損傷發生，修復無力，產生各種病理狀態。PI/AI能夠反映細胞增殖與凋亡的比例是否平衡［10］。本研究結果顯示：COPD大鼠膈肌細胞增殖與凋亡平衡失調，導致以膈肌細胞凋亡為主要過程的病理改變，而高劑量培土生金方能通過調節膈肌細胞增殖與凋亡平衡，減緩膈肌細胞凋亡過程，防止膈肌疲勞的過早或反復發生，增強COPD呼吸功能，改善呼吸衰竭。低劑量培土生金方則對此調節過程無影響。

中醫學將COPD膈肌疲勞歸屬于“喘證”、“虛喘”、“喘脫”等范疇，多由久咳、久喘不愈而發。肺屬金、脾屬土，土生金，脾肺特殊的五行母子關系和生理病理上的相互作用決定了COPD培土生金法的治療原則。一方面，《醫碥》有云：“飲食入胃，脾胃運行其精美之氣，雖曰周布四臟，實先上輸于肺，肺氣受其益，是為脾土生肺金，肺受脾之義，則氣愈旺，化水下降，澤及百體”。故脾旺則肺氣充盛，肺主氣功能正常，宣降和諧，咳喘無源。另一方面，脾主肌肉，為氣血生化之源，人體營養物質的產生和吸收靠脾胃對水谷精微的化生和輸布，膈肌也有賴于脾胃化生水谷精微得以豐碩，從而有力調控呼吸運動，改善呼吸困難，減緩呼吸衰竭的發生。基于以上中醫理論，培土生金法能改善COPD咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀，延緩膈肌疲勞的發生。本研究結果表明：高劑量培土生金方能加快COPD大鼠體質量增長速度，改善其營養狀況，通過調節膈肌細胞增殖與凋亡比例，維持細胞增殖/凋亡平衡，加強膈肌損傷后修復過程，明顯降低COPD大鼠膈肌細胞的凋亡。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Therapy of Supplementing Spleen to Strengthen Lung on Proliferation and Apoptosis of Diaphragmatic Muscle Cells in Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

SONG Jing，SUN Zhijia
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Abstract：Objective To observe the effect of therapy of supplementing spleen to strengthen lung on the proliferation and apoptosis of the diaphragmatic muscle cells in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）.Methods Forty Wistar rats were randomly divided into blank group，model group，high-dose Chinese medicine group（modified Chen Xia Liujunzi Decoction at 71.82 g·kg-1·d-1）and low-dose Chinese medicine group（modified Chen Xia Liujunzi Decoction at 17.96 g·kg-1·d-1）.The rat model of COPD was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide（LPS）combined with exposure to cigarette smoking.The general health status and the body weight of rats were observed.Pathologic changes of diaphragm tissues were observed after hematoxylin-eosin（HE）staining.Immunohistochemistry was used to determine proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression in diaphragm tissues，and then we calculated the cellular proliferation index（PI）.Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling method（TUNEL）was used to examine the apoptosis of diaphragmatic muscle cells，and then we calculated the apoptotic index（AI）as well as the ratio of PI/AI.Results Compared with the blank group，the body weight of the model group was significantly decreased（P＜0.01），the AI was significantly increased（P＜0.01），and PI/AI was significantly lowered（P＜0.01）.Compared with the model group，the body weight of high-dose Chinese medicine group was increased significantly（P＜0.01），AI was significantly lowered（P＜0.01），and PI/AI was significantly enhanced （P＜0.01）.Conclusion The therapeutic mechanism of therapy of supplementing spleen to strengthen lung for COPD is probably related to keeping the balance between apoptosis and proliferation of diaphragm muscle cells and to the reduction of the apoptosis of diaphragm muscle cells.

Keywords：supplementing spleen to strengthen lung；Chen Xia Liujunzi Decoction；chronic obstructive pulmonary disease/TCD therapy；diaphragm/pathology；apoptosis；disease model，animal；rats

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0342 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．015

收稿日期：2015-12-03

作者簡介：宋璟（1986-），女，博士研究生；E-mail：lovecindy314@163.com

通訊作者：孫志佳（1965-），男，教授，主任醫師；E-mail：13710848770@163.com

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（編號：2006CB504600）