膿毒癥患者外周血單核細胞PD-L1/PD-1表達及臨床意義

劉敏龍， 趙玉杰， 陳海燕， 張小玲， 劉媛媛， 王國恩*

(1西安交通大學第二附屬醫院重癥醫學科，西安　710004； 2西安交通大學第二附屬醫院科研中心實驗室； *通訊作者，E-mail:guoenw@126.com)

膿毒癥患者外周血單核細胞PD-L1/PD-1表達及臨床意義

劉敏龍1， 趙玉杰1， 陳海燕2， 張小玲1， 劉媛媛1， 王國恩1*

(1西安交通大學第二附屬醫院重癥醫學科，西安710004；2西安交通大學第二附屬醫院科研中心實驗室；*通訊作者，E-mail:guoenw@126.com)

摘要：目的觀察膿毒癥患者外周血單核細胞(PBMC)的程序性細胞死亡因子-1(programmed cell death-1,PD-1)及其配體(programmed cell death-1 ligand,PD-L1)表達變化并探討其臨床意義。方法收集2015-01～2015-10入住我科的膿毒癥患者38例，對照組為健康人15例。采集膿毒癥患者外周血，采集時間點為入住ICU第1天、第3-4天、第7-8天,分離PBMC。流式細胞技術檢測單核細胞、樹突細胞PD-L1表達及CD8+T淋巴細胞PD-1表達。并記錄相應時間點中性粒細胞和淋巴細胞絕對計數。結果與對照組相比，膿毒癥患者入住ICU第1天、第3-4天及第7-8天的單核細胞PD-L1表達和CD8+T淋巴細胞均明顯升高(P<0.01)；膿毒癥患者入住ICU第1天、第3-4天樹突細胞PD-L1表達均明顯升高(P<0.05)、第7-8天的樹突細胞PD-L1表達有升高趨勢,但差異沒有統計學意義(P>0.05)。Spearman相關分析，樹突細胞PD-L1表達與中性粒細胞絕對計數呈正相關(rs=0.272，P=0.018)。結論患者PBMC的PD-L1/PD-1上調表達可能反映膿毒癥誘導的免疫抑制。

關鍵詞：膿毒癥；外周血單核細胞；程序性細胞死亡因子配體-1；程序性細胞死亡因子-1

繼發性感染和免疫功能抑制是膿毒癥患者死亡的原因之一[1,2]。程序性細胞死亡因子-1(programmed cell death-1,PD-1)及其配體(programmed cell death-1 ligand,PD-L1)是細胞膜表面分子，PD-1主要表達在免疫細胞，PD-L1在上皮細胞、內皮細胞及免疫細胞均有表達。PD-1/PD-L1膜分子屬于協同抑制分子，發揮負性免疫調節作用[3]。新近腫瘤免疫治療臨床研究指出，以癌旁免疫細胞的PD-L1表達水平為依據，應用抗PD-L1單克隆抗體治療膀胱癌發現，癌旁免疫細胞高表達PD-L1者治療效果明顯，部分患者腫瘤體積明顯縮小[4]。因此，我們推測PD-1/PD-L1膜分子表達水平可用于評估機體免疫狀態。研究報道，PD-1/PD-L1途徑參與膿毒癥免疫抑制的發生發展。我們動物試驗證實膿毒癥小鼠單核細胞PD-L1高表達[5]。查閱文獻，關于膿毒癥患者外周血單核細胞(PBMC)的PD-L1/PD-1表達變化研究報道較少。本研究旨在于檢測膿毒癥患者PBMC的PD-L1/PD-1膜分子的表達情況，為膿毒癥的免疫狀態監測和治療提供理論依據。

1資料與方法

1.1研究對象和分組

①膿毒癥組。膿毒癥的診斷標準：患者表現全身炎癥反應綜合征+明確感染灶或高度懷疑存在感染灶。排除標準:年齡<18歲，合并乙型肝炎、結核病、艾滋病、腫瘤晚期廣泛轉移及長期應用糖皮質激素和免疫抑制劑患者。共收集西安交通大學第二附屬醫院重癥醫學科2015-01-2015-10的膿毒癥患者56例，符合入組標準38例，男26例，女11例，平均年齡68.3歲(29-91歲)。評估并記錄患者在相應采血時間點的急性生理和慢性健康評分(APACHEⅡ)和序貫性器官功能衰竭評分(SOFA)；記錄相應時間點中性粒細胞絕對計數(absolute neutrophil count，ANC)和淋巴細胞絕對計數(absolute lymphocyte count，ALC)；追蹤并記錄患者入住ICU后28 d生存狀況。②正常對照組為同期健康體檢者，共15例，其中男10例，女5例，平均年齡39.9歲(22-65歲)。本研究獲醫院倫理委員會審查通過，患者或其代理人均簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器免疫熒光抗體

FITC-anti-human-CD11c、PerCP-anti-human-CD14、PE-anti-human-PD-L1、PerCP-anti-human-CD8+、PE-anti-human-PD-1及同型對照抗體購自美國Biolegend公司。流式細胞儀為BD FACSAria Ⅱ。

1.3標本采集

采集外周血時間點分別為膿毒癥患者入住ICU第1天、第3-4天、第7-8天。采集外周血5 ml，其中EDTA抗凝管3 ml。收集后迅速送我院中心實驗室，EDTA抗凝管血樣采用密度梯度離心法離心，分離人外周血單核細胞(PBMC)。分離成功后細胞凍存液保存，程序降溫，最終至液氮保存。

1.4流式細胞儀檢測

將細胞從液氮中快速取出，按照標準細胞復蘇程序復蘇，復蘇成功后加入1640培養液進行細胞計數。每個患者分兩個待檢測流式管，細胞數各調至1×106個，加Fc阻滯劑，振蕩混勻，冰上避光孵育5 min。一管分別加入FITC-anti-human-CD11c、PerCP-anti-human-CD14、PE-anti-human-PD-L1抗體各1test，另一管分別加入PerCP-anti-human-CD8+、PE-anti-human-PD-1各1test，冰上避光孵育30 min。加入2 ml含1%胎牛血清PBS液500 μl混勻洗滌，300×g離心5 min，去上清后用含1%胎牛血清PBS液再洗滌一遍，加入400 μl含1%胎牛血清PBS液4 ℃避光1 h內上機檢測。每次檢測均設陰性、同型和單染管對照。

1.5統計分析

2結果

2.1不同時間點膿毒癥患者例數及入住ICU后28 d生存狀況

入住ICU第1天38例，第3-4天24例，第7-8天13例。入住ICU后28 d生存21例，死亡14例，放棄3例。

2.2各組PBMC中PD-L1及PD-1的表達

與對照組相比，膿毒癥患者住ICU第1天、第3-4天及第7-8天的PBMC的PD-L1及PD-1表達明顯升高(見表1)。PBMC的PD-L1及PD-1表達的典型流式細胞圖見圖1-3。

表1對照組和膿毒癥患者PBMC的PD-L1、PD-1表達(%)

Table 1PD-L1 and PD-1 expression on PBMC in healthy control and sepsis patients(%)

組別單核細胞PD-L1樹突細胞PD-L1CD8+T淋巴細胞PD-1對照組0.12(0.05)0.08(0.05)0.07(0.05)膿毒癥組 第1天 0.45(0.16)**0.12(0.08)*0.10(0.08)* 第3-4天 0.42(0.12)**0.11(0.05)*0.12(0.10)* 第7-8天 0.38(0.23)** 0.09(0.07)**0.15(0.09)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；數據不符合正態分布，以中位數(四分位數間距)表示

A.對照組　　　　　　　　　　　　　B.膿毒癥組橫坐標PE通道標記單核細胞，縱坐標PerCP通道標記PD-L1，Q2-3為單核細胞的PD-L1雙陽表達水平圖1　PD-L1在對照組和膿毒癥組單核細胞表達Figure 1　PD-L1 expression on monocytes in health controls and sepsis patients

A.對照組　　　　　　　　　　　　B.膿毒癥組橫坐標FITC通道標記CD11樹突細胞，縱坐標PE通道標記PD-L1，Q2為樹突細胞PD-L1雙陽表達水平圖2　PD-L1在對照組和膿毒癥組樹突細胞表達Figure 2　PD-L1 expression on dendritic cell in health control and sepsis patients

A.對照組　　　　　　　　　　　　B.膿毒癥組橫坐標PE通道標記CD8+T淋巴細胞，縱坐標PerCP通道標記PD-1，Q2-3為CD8+T淋巴細胞的PD-1雙陽表達水平圖3　PD-1在對照組和膿毒癥組的CD8+T淋巴細胞的表達Figure 3　PD-1 expression on CD8+T lymphocyte in health control and sepsis patients

2.3膿毒癥患者PBMC中PD-L1及PD-1表達與APACHEⅡ和SOFA評分的相關分析

危重癥評分以中位數(四分位間距)表示，膿毒癥患者APACHEⅡ評分19(10)，SOFA評分8(11)。膿毒癥患者樹突細胞PD-L1表達與APACHEⅡ評分(rs=-0.167，P=0.147)和SOFA評分(rs=-0.081，P=0.485)無相關性；單核細胞PD-L1表達與APACHEⅡ評分(rs=-0.210，P=0.067)和SOFA評分(rs=-0.145，P=0.207)無相關性；CD8+T淋巴細胞PD-1表達與APACHEⅡ評分(rs=-0.069，P=0.553)和SOFA評分(rs=-0.040，P=0.730)無相關性。

2.4膿毒癥患者入住ICU后28 d生存組與死亡組的PBMC中PD-L1、PD-1表達比較

與死亡組比較，生存組的樹突細胞和單核細胞PD-L1表達、CD8+T淋巴細胞PD-1表達、ANC和ALC均無統計學差異(P>0.05，見表2)。

表2幸存組和死亡組的PBMC的PD-L1、PD-1表達及中性粒細胞和淋巴細胞絕對計數

Table 2PD-L1,PD-1 expression on PBMC and ANC,ALC between survivals and dead patients

組別 n樹突細胞PD-L1(%)單核細胞PD-L1(%)CD8+T淋巴細胞PD-1(%)中性粒細胞(×109/L)淋巴細胞(×109/L)生存組210.12(0.08)0.46(0.13)0.11(0.06)12.7±8.71.3±1.0死亡組140.11(0.09)0.42(0.27)0.14(0.10)10.8±6.51.0±0.6

2.5ANC和ALC與PBMC中PD-L1、PD-1表達的相關性分析

ANC與單核細胞PD-L1表達無相關(rs=0.224，P=0.053)，與樹突細胞PD-L1表達呈正相關(rs=0.272，P=0.018)，與CD8+T淋巴細胞無相關(rs=-0.106，P=0.364)；ALC與單核細胞PD-L1表達無相關(rs=0.014，P=0.905)，與樹突細胞PD-L1表達呈正相關(rs=0.088，P=0.905 453)，與CD8+T淋巴細胞無相關(rs=023，P=0.848)。

3討論

研究指出，T淋巴細胞活化依賴雙信號模式，第一信號通路為抗原遞呈細胞(APC)吞噬病原體將其在細胞內加工后以HLA-DR復合物形式遞呈給T淋巴細胞，同時APC表達包括CD86、CD80及PD-L1等第二信號與T淋巴細胞結合，其中CD80和CD86通路的信號效應表現為T淋巴細胞增殖活躍和白介素-2等細胞因子生成增加，表現T淋巴細胞功能活躍；PD-L1與PD-1通路信號效應是PD-L1與淋巴細胞表達的PD-1結合導致T淋巴細胞增殖抑制和白介素-10生成增加，表現為T淋巴細胞功能抑制[6]。因此PD-L1/PD-1途徑為負性免疫調節通路，該通路的上調表達可能預示免疫功能處于抑制狀態。

我們以往動物實驗基礎研究[5]已經證明，膿毒癥小鼠的單核細胞高表達PD-L1，本臨床研究也證實這一結果，而且證實了樹突細胞PD-L1和CD8+T淋巴細胞的PD-1上調表達，這說明PD-L1/PD-1這一負性免疫調節通路可能參與膿毒癥的發生發展。文獻報道膿毒癥患者的CD8+T淋巴細胞PD-1表達增加，體外應用PD-1單克隆抗體阻斷PD-L1/PD-1途徑，表現為T淋巴細胞的凋亡減少[7]。研究PD-1基因敲除膿毒癥小鼠發現，基因敲除小鼠的生存率高且細菌負荷小[8]。動物研究證實，敲除PD-L1膿毒癥小鼠生存率高于野生型小鼠，其器官組織損傷程度和循環細胞因子水平前者明顯低于后者[9]。以上研究說明PD-L1/PD-1通路不僅參與膿毒癥的發生發展，而且可能影響膿毒癥的結局。因此有學者認為PD-L1/PD-1通路將是膿毒癥免疫治療很有前景的靶點。2014年有學者報道用PD-L1單克隆抗體(MPDL3280A)治療轉移膀胱癌的臨床研究[9]。研究者將患者送檢標本進行免疫組織化學染色，依據高倍鏡下陽性PD-L1細胞數量將患者分為4類。結果顯示在癌旁免疫細胞高表達PD-L1患者中，部分患者轉移癌組織明顯縮小[4]。該結果從另一側面說明采用PD-L1/PD-1通路進行靶向免疫治療的可行性。

有研究報道白細胞PD-L1表達水平在APACHEⅡ≥20危重患者較APACHEⅡ<20者明顯增高[10]，Guignant等[2]報道CD4+T淋巴細胞PD-1在膿毒癥休克患者高表達且與死亡率相關，據此我們推測單核細胞PD-L1表達水平和CD8+T淋巴細胞PD-1表達水平與危重癥評分可能有關，但本研究發現單核細胞、樹突細胞的PD-L1表達和CD8+T淋巴細胞PD-1表達分別與APACHEⅡ和SOFA評分無關。將生存組和死亡組之間進一步比較分析，發現兩組間單核細胞、樹突細胞的PD-L1表達和CD8+T淋巴細胞PD-1的表達差異無統計學意義。以上均這說明膿毒癥免疫細胞PD-L1/PD-1表達可能與病情輕重無關。該結果與以往報道[2,10]不一致，這可能與我們研究例數較少有關，仍需要進一步擴大樣本研究。

膿毒癥免疫功能障礙包括淋巴細胞的耗竭和低的淋巴細胞計數等問題[11,12]。APC表達PD-L1與T淋巴細胞表達PD-1結合誘導淋巴細胞凋亡可能是淋巴細胞耗竭的原因之一[12]。但研究指出單核細胞PD-L1表達或T淋巴細胞PD-1表達與ALC無相關性[12]，我們研究得出同樣結果，這樣的結果與PD-L1/PD-1通路誘導淋巴細胞凋亡理論不一致，內在原因需要進一步探討。我們分析可能在于膿毒癥時體內多種組織細胞表達PD-L1，表達組織包括脾臟、腎臟和肝臟，表達的免疫細胞更廣泛，除了APC外，膿毒癥中性粒細胞PD-L1也高表達[5,13-15]。因此，我們推測膿毒癥時是多種組織及細胞表達PD-L1集合作用T淋巴細胞PD-1，進而誘導T淋巴細胞凋亡，所以采用單一某個細胞PD-L1表達水平做相關性分析就很難得出陽性結果。雖然如此，本研究發現ANC與與樹突細胞PD-L1表達呈正相關(rs=0.272，P=0.018)，這種相關性是否存在內在的生物學意義仍需要探討。

總之，PD-L1/PD-1膜分子在膿毒癥患者PBMC呈現高表達，說明該負性免疫調節通路參與膿毒癥免疫細胞狀態的發生發展，檢測免疫細胞PD-L1/PD-1表達將可能提示膿毒癥的負性免疫水平。

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PD-1/PD-L1 expression in peripheral blood mononuclear cells and its clinical value in septic patients

LIU Minlong1,ZHAO Yujie1,CHEN Haiyan2,ZHANG Xiaoling1,LIU Yuanyuan1,WANG Guoen1*

(1DepartmentofCriticalCareMedcine,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China；2CoreResearchLaboratory,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:guoenw@126.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the expression of programmed cell death-1(PD-1) and its ligand(PD-L1) on peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in septic patients and evaluate its clinical value.MethodsTotally 38 septic patients and 15 healthy controls(HC) were enrolled in this study. Blood samples were collected from septic patients at day 1 after admission to the ICU, days 3-4, and days 7-8.PBMC was obtained to detect PD-L1 expression on monocytes, dendritic cells and PD-1 expression on CD8+T cells by flow cytometry. Absolute neutrophil count and absolute lymphocyte count were recorded simultaneously.ResultsExpression of PD-L1 on monocytes(P<0.01) and PD-1 on CD8+T cells(P<0.05) at each time point in septic patients were increased compared with controls. Expression of PD-L1 on dendritic cells at day 1 and days 3-4 in septic patients was increased compared with controls(P<0.05), and increased at day 7-8, but there was no significant difference(P>0.05). Spearman analysis showed a positive correlation between PD-L1 expression on dendritic cells and absolute neutrophil count(rs=0.272，P=0.018).ConclusionIncreased expression of PD-L1/PD-1 on PBMC might reflect the immunosurpression induced by sepsis.

Key words:sepsis;peripheral blood mononuclear cells;programmed cell death-1 ligand;programmed cell death-1

基金項目：陜西省科學技術研究發展計劃基金資助項目(2014k11-02-01)；西安交通大學第二附屬醫院新技術準入項目(17)

作者簡介：劉敏龍，男，1976-04生，在讀博士，主治醫師，E-mail:liuminlong2010@sina.cn

收稿日期：2016-02-24

中圖分類號：R

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0526-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.009