急進高原對大鼠胃電活動及胃Cajal間質細胞微觀結構和功能的影響

朱　琳， 賀　巍， 楊生岳， 范興愛， 劉睿年， 陳　磊

(解放軍第四醫院消化內科，西寧　810007； *通信作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

急進高原對大鼠胃電活動及胃Cajal間質細胞微觀結構和功能的影響

朱琳， 賀巍*， 楊生岳， 范興愛， 劉睿年， 陳磊

(解放軍第四醫院消化內科，西寧810007；*通信作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

摘要：目的探討急進高原后不同海拔高度及不同時間節段下大鼠胃電活動變化及其對胃Cajal(interstitial cell of Cajal，ICC)間質細胞微觀結構和功能的影響。方法130只SD雄性大鼠隨機分為低海拔地區組(西安，海拔400 m)，中度海拔地區(西寧，海拔2 260 m)和高海拔地區(瑪多，海拔4 300 m)，中度和高度海拔組又以急進高原的時間分為1 d，3 d，5 d，7 d，10 d和14 d組，每組10只大鼠。測定各組大鼠胃電活動數據，并應用免疫熒光染色及電子顯微鏡觀察胃電起搏區ICC的功能及微觀結構變化。結果大鼠胃電的波幅及波頻在中度海拔地區5 d組及高海拔地區3 d組下行到最低點(P<0.05)，且高海拔地區3 d組受損更加明顯(P<0.05)。大鼠胃電起搏區ICC的功能及微觀結構也可同步觀察到類似改變，于中度海拔地區5 d組及高海拔地區3 d組受損最明顯，電鏡下可觀察到ICC的縫隙連接減少、細胞器減少并出現凋亡小體等，并以高海拔地區3 d組最顯著。用c-kit免疫熒光標記同部位ICC，也可觀察到中度海拔地區5 d組及高海拔地區3 d組免疫熒光強度最低(P<0.05)，且高海拔地區3 d組降低更顯著(P<0.05)。結論急進高原對于大鼠胃電活動影響顯著，且海拔高度越高，大鼠胃電活動受損越嚴重，下行的速度越快，越早到達最低點。大鼠胃電起搏區的ICC微觀結構及功能也出現相應同步損害，表明，ICC可能在急進高原胃動力紊亂形成機制中廣泛參與并發揮重要作用。

關鍵詞：高原病；高海拔；胃動力；Cajal間質細胞；大鼠

近年來隨著經濟發展及交通條件的大幅改善，尤其是青藏鐵路的開通，每年因旅游、科研、朝圣及工作需要等原因進入青藏高原活動的人數多達數百萬[1]，而高原獨有的氣壓低、含氧低、氣溫低、紫外線強等自然環境會對機體造成很多影響，從而引發呼吸、循環、神經、消化等多系統損傷，產生功能紊亂[2]。其中，急進高原胃腸動力紊亂是高原胃腸應激反應的主要表現之一，以腹脹、惡心、嘔吐、腹瀉、食欲減退等消化道癥狀最為突出，這些癥狀一般經7-10 d的高原適應后逐漸減輕或消失[3]。

目前有關于高原胃腸動力紊亂的研究多集中在臨床及部分基礎研究上，以應用B超、X線鋇餐、激素測定、內鏡等檢查手段觀測高原應激時的胃腸動力變化為主，而詳細探討高原胃腸動力紊亂變化規律，以及其形成機制的細胞分子生物學領域的研究則少見報道[4]。另外，既往的研究表明ICC具有產生、傳播慢波的功能，并以胃電發生起搏細胞的角色，在胃腸道動力的產生及調控中發揮關鍵作用[5-7]。那么急進高原后大鼠胃運動發生紊亂時，其胃電活動是如何發生變化的，胃電起搏區ICC的微觀結構及功能是否也存在相應改變，它們之間有何關聯變化，將是我們研究的重點。本實驗將測定急進高原不同海拔不同時間節點下大鼠胃電活動變化情況，并同時使用電子顯微鏡及免疫熒光標記的方式，觀察急進高原對大鼠胃電起搏區ICC微觀結構及功能的影響，為進一步探討急進高原胃腸動力紊亂的發生機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要儀器及試劑

RM6280B生物信號采集處理系統(成都儀器廠生產)，超低溫冰箱(-80 ℃)及超低溫切片機(美國NUAIR公司)，FV1000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，TecnaiG2分析透射電鏡(美國FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(LifeSpan BioSciences公司)，羊抗兔IgG alexa fluor 594單克隆抗體(美國Jackson公司)。

1.2實驗動物與分組

SD雄性大鼠130只，SPF級，許可證號：SCXK(陜)2012-003，體重(200±20)g，全部購自西安交通大學實驗動物中心，所有實驗大鼠隨機分為3大組13小組。即以實驗地區海拔高度劃分3大組，A組低海拔地區組(西安，海拔400 m)、B組中度海拔地區組(西寧，海拔2 260 m)、C組高海拔地區組(瑪多，海拔4 300 m)。另以大鼠起運后3 d內進駐實驗現場模擬急進高原狀態，并以進駐后的時間節點為依據，依達到實驗地區后的時間順序于B、C兩組下設6個亞組，即：1 d,3 d,5 d,7 d,10 d,14 d組，每組10只大鼠。

1.3胃電生理活動檢測

SD大鼠術前12 h禁食，術前6 h禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，通過大鼠腹部正中切開，選擇胃電起搏區的胃體中部上1/3處漿膜層埋置引導電極[8]，測量胃電活動變化，參數設定為“生物電，500 mV，直流，30 Hz”，記錄波形并分析。

1.4實驗標本的采集與固定

電生理測定完成后處死大鼠，剪開胸腔，經升主動脈插管，快速灌入生理鹽水沖去血液，并沿胃大彎測剪開，于胃體中部上1/3處取0.2 cm×0.1 cm大小組織，放入3%戊二醛固定用于電鏡染色，后繼續經升主動脈先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH7.4)500 ml，注畢立即取全胃置于20%的蔗糖溶液中過夜沉底。

1.5電鏡觀察胃電起搏區ICC細胞微觀結構變化

取3%戊二醛固定后組織用0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，再用2%的四氧化鋨后固定1 h，丙酮中梯度脫水，在1%醋酸雙氧鈾中停滯染色1 h，再通過環氧丙烷與環氧樹脂。1 mm切片用亞甲藍染色，在光鏡下觀察，確定黏膜層、環形肌層、縱行肌層，再次經70 nm超薄切片后用酒精醋酸雙氧鈾、再用檸檬酸鹽后染色，保留縱行肌層、環形肌層、黏膜下層、部分黏膜層，用透射電鏡觀察、照相。

1.6免疫熒光化學法標記ICC后圖像分析

取固定后胃體中部上1/3處0.4 cm×0.2 cm組織用超低溫切片機切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS反復漂洗3次后，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)，再經0.01 mol/L PBS液漂洗后進行免疫組織化學熒光染色(以c-kit抗體標記ICC細胞)：加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(1∶150)孵育24 h(室溫)，經0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，所有切片均加入羊抗兔IgG alexa fluor 594單克隆抗體(1∶300)，避光孵育2 h(室溫)。經0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片，以上過程均需避光操作。各組切片各取10張，在FV1000激光共聚焦顯微鏡下采用20倍及40倍視野觀察，觀察每一張切片取6-8個視野，并將數字化圖像儲存。

1.7統計學分析

2結果

2.1急進高原后大鼠在中度海拔及高海拔地區各時間段下的電生理變化

急進高原后隨著海拔高度的升高，胃電的波頻及波幅受損明顯，且海拔高度越高，受損下行越快，越早到達最低點(見表1，2，圖1)。在中度海拔地區胃電波頻變化不明顯，僅在5 d組出現統計學差異(P<0.05)，而波幅相對變化顯著，1 d組即可觀察到明顯變化(P<0.05)，至5 d組下降到最低點(P<0.05)。而高海拔地區則可以觀察到明顯波頻、波幅變化，并均于3 d組達到最低點(P<0.05)，且高海拔地區大鼠胃電活動受損情況較中度海拔地區最低點時顯著下降，高海拔1 d組與中度海拔1 d組比較，高海拔3 d組與中度海拔5 d組比較差異均有統計學意義。另外通過實驗觀察可見，海拔高度對于波頻的影響相對較低，較易恢復，中度海拔地區在7 d組，高海拔地區在5 d組即基本恢復正常，與低海拔組相比無統計學差異(P>0.05)，而波幅恢復相對較慢，且所處海拔高度越高恢復越慢。

組別1d3d5d7d10d14d低海拔組1839.31±611.46 中度海拔組 581.96±207.22*259.77±28.71 222.08±55.04#264.68±38.73430.77±147.64670.12±169.74高海拔組 265.30±39.52*△173.98±26.29▲★214.25±44.01333.31±81.87391.83±78.84507.67±108.25

與低海拔組比較，*P<0.05；與中度海拔1 d組比較，△P<0.05；與中度海拔5 d組比較，▲P<0.05; 中度海拔組與3 d及7 d組比較，#P<0.05；高海拔組與1 d及5 d組比較，★P<0.05

組別1d3d5d7d10d14d低海拔組49.67±0.96中度海拔組49.56±0.7748.72±1.6748.54±2.11*49.45±0.8649.8±0.3249.84±0.44高海拔組 48.42±1.48*△ 44.63±0.87#▲49.21±1.02 49.4±1.2549.71±0.6 49.88±0.33

與低海拔組比較，*P<0.05；與中度海拔1 d組比較，△P<0.05；與中度海拔5 d組比較，▲P<0.05；高海拔組與1 d及5 d組比較，#P<0.05

A為低海拔組； B1-B6分別為中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組； C1-C6分別為高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組 圖1　大鼠快速進入高海拔地區后胃電活動時程變化Figure 1　Effects of ascending to high altitude on gastric electrical activity in the rats

2.2急進高原后大鼠在中度海拔及高海拔地區各時間段下胃電起搏區的ICC的微觀結構變化

低海拔地區對照組ICC在電鏡下觀察可見：細胞結構完整，縫隙連接緊密，核周細胞質充盈，細胞器數量較多，細胞內部罕見空泡樣改變，無凋亡小體。急進高原地區后，細胞微觀結構受外界環境影響、受損，尤其在中度海拔地區5 d組及高海拔地區3 d組表現最為明顯。ICC細胞縫隙連接變得松散、減少；核周細胞質空泡樣改變加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；細胞內細胞器數量明顯減少，細胞線粒體可見空泡樣腫脹，部分可見內質網輕度擴張；部分形成核固縮，核內可見異染色質，凋亡小體明顯增多；更嚴重的可見尚存細胞的連接結構明顯破壞，連接松散，核周胞質顯著減少，線粒體腫脹變性，空洞隨處可見，核內可見大量凋亡小體及異染色質(見圖2)。

2.3急進高原后大鼠在中度海拔及高海拔地區各時間段下胃電起搏區的c-kit表達的變化

實驗結果表明，不論是中度海拔地區還是高海拔地區，與低海拔地區對照組相比，大鼠胃電起搏區c-kit表達明顯下降，1 d組即出現明顯變化(P<0.05)，且進入地區的海拔高度越高下降幅度越快，中度海拔地區于5 d組到達最低點(P<0.05)，高海拔地區于3 d組下行到最低點(P<0.05)，而后緩慢恢復。且海拔越高影響越嚴重，高海拔地區3 d組與中度海拔地區5 d組比較c-kit表達強度明顯減弱(P<0.05，見表3，圖3)。

A1,A2為低海拔組； B1-B6分別為中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組； C1-C6分別為高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組圖2　大鼠快速進入高海拔地區后對胃電起搏區ICC細胞微觀結構的影響Figure 2　Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the gastric pacing location

組別1d3d5d7d10d14d低海拔組45.85±1.78中度海拔組37.36±1.72*35.88±1.67 33.4±1.71#35.32±1.5936.14±1.7937.29±2.46高海拔組33.27±2.05*△30.77±1.98▲★31.87±1.9333.1±2.1833.57±1.7935.95±2.01

與低海拔組比較，*P<0.05；與中度海拔1 d組比較，△P<0.05；與中度海拔5 d組比較，▲P<0.05;中度海拔組與3 d組及7 d組比較，#P<0.05; 高海拔組與1 d組及5 d組比較，★P<0.05

A，Aa為低海拔組； B1-B6分別為中度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組； C1-C6分別為高度度海拔1 d，3 d，5 d，7 d，10 d，14 d組圖3　大鼠快速進入高海拔地區后對胃電起搏區c-kit表達變化Figure 3　Expression of c-kit in ICCs in rats gastric pacing location after ascending to high altitude

3討論

初入高原者易引發機體低張性缺氧，為了保障心、腦等重要臟器的供養，機體需調整體內血液分布進而收縮皮膚及胃腸道血管，造成一系列消化道癥狀。高原胃腸應激反應是急性高原病的常見表現，消化系統功能障礙甚至能夠進一步加重其他原發高原疾病的病情，造成嚴重后果[9]。目前在高原胃腸動力紊亂的研究領域，有關胃腸電節律規律性變化的研究、報道尚不多，尤其是詳細描述整個受損、恢復過程的報道尚罕見。目前已知的研究表明ICC作為慢波的起源細胞可與腸神經系統(enteric nervous system，ENS)及消化道平滑肌(smooth muscle cell，SMC)形成網絡狀連接，并組成胃腸動力的基本功能單位(basically functional unit GI motility，BFUGM)[10]，它同時與抑制性和興奮性神經纖維形成緊密聯接，在ENS和SMC之間的進行信息傳遞[4]，進而影響胃腸的基本電節律造，并以此來調控胃腸運動[11-14]。近年來大量的研究表明[15-17]，諸多胃腸動力障礙疾病的患者存在ICC功能的損傷，如：糖尿病胃輕癱、慢性便秘、功能性消化不良等，其主要表現在ICC數量的減少、缺失及ICC網絡的受損及神經遞質分泌異常等，并最終導致慢波的異常，進而引起胃腸動力疾病或障礙。可以看出在胃腸動力障礙疾病的研究領域中，ICC細胞的地位不容忽視，十分重要。

通過觀察急進高原后大鼠胃電活動的變化規律可以發現，海拔高度對大鼠胃電活動影響明顯，進入地區的海拔高度越高，受損越嚴重，胃電活動下行的速度越快，尤以波幅為著。在中度海拔地區1 d組大鼠胃電波幅下降顯著而波頻下降不明顯，于5 d組胃電波幅降至最低谷時胃電波頻才顯著下降，此后胃電波頻快速恢復，而波幅則恢復相對緩慢。高海拔地區測量結果與之類似，但大鼠胃電活動受損更為明顯，不論波頻還是波幅均在1 d組即可觀察到顯著下降，并于3 d組到達最低點，且其下行幅度與中度海拔地區5 d組相比受損更加嚴重，同樣是波頻先恢復，而波幅恢復速度較西寧地區更加緩慢。此外，使用電子顯微鏡觀察各組大鼠胃電起搏區ICC細胞微觀結構的變化，并結合ICC表達量的變化進行分析，可以發現類似的損傷變化規律，即急進高原大鼠胃電活動受損發生下行變化時，ICC的微觀結構及表達量也同步發生損傷變化，海拔高度越高，ICC微觀結構受損越嚴重，代表ICC表達量的免疫熒光強度值越低，并同樣于中度海拔5 d組、高海拔3 d組下行到最低點，且后者下降幅度更大，恢復更慢。可見大鼠進入高海拔地區后，其胃電活動變化與胃電起搏區ICC微觀結構及功能變化存在明顯的關聯性，因此我們分析急速進入高海拔地區后，在胃動力紊亂的發生機制中，ICC細胞可能廣泛參與其中并發揮重要作用，這將為我們以后進一步探討急進高原胃腸動力紊亂的發生機制提供基礎理論依據。

參考文獻：

[1]Wu TY,Ding SQ,Liu JL,etal.Who should not go high:chronic disease and work at altitude during construction of the Qinghai-Tibet railroad[J].High Alt Med Biol,2007,8(2):88-107.

[2]Debudaj A,Bobiński R.The pathophysiology of acute mountain sickness(Article in Polish)[J].Pol Merkur Lekarski,2010,28(168):478-481.

[3]高鈺琪.高原軍事醫學[M].重慶：重慶出版社，2005：106-110.

[4]朱琳，賀巍，楊生岳，等.Cajal間質細胞在急進高原胃腸動力紊亂中的作用的展望[J].現代生物醫學進展，2013，13(34):6786-6790.

[5]Rich A,Hanani M,Ermilov LG,etal.Physiological study of interstitial cells of Cajal identified by vital staining[J].Neurogastroenterol Motil,2002,14(2):189-196.

[6]Daniel EE,Thomas J,Ramnarain M,etal.Do gap junctions coupleinterstitial cells of Cajal pacing and neurotransmission to gastrointestinal smooth muscle?[J].Neurogastroenterol Motil,2001,13(4):297-307.

[7]Huizinga JD.Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal:from bench to bedside.Ⅱ.Gastric motility:lessons from mutant mice on slow waves and innervation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,281(5):G1129-1134.

[8]黃裕新，王偉，夏德雨，等.白蘿卜提取物促胃動力作用中Cajal間質細胞與P物質的變化[J].胃腸病學和肝病學雜志，2008，17(6):467-469.

[9]武金寶，王繼德，張亞歷.腸黏膜屏障研究進展[J].世界華人消化雜志，2003，11(5):619-623.

[10]Wang XY,Vannucchi MG,Nieuwmeyer F,etal.Changes in interstitial cells of Cajal at the deep muscular plexus are associated with loss of distention-induced burst-type muscle activity in mice infected by Trichinella spiralis[J].Am J Pathol,2005,167(2):437-453.

[11]Bielefeldt K,Conklin JL.Intestinal motility during hypoxia and reoxygenation in vitro[J].Dig Dis Sci,1997,42(5):878-884.

[12]Huizinga JD,Thuneberg L,etal.Interstitial cells of cajal as targets for pharmacological intervention in gastrointestinal motor disorders[J].Trends Pharmacol Sci,1997,18(10):393-403.

[13]孫金山，王寶西.Cajal間質細胞與胃腸動力疾病[J].中國當代兒科雜志，2006，8(2):164-168.

[14]Wu MJ,Kee KH,Na J,etal.Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide inhibits pacemaker activity of colonic interstitial cells of Cajal[J].Korean J Physiol Pharmacol,2015,19(5):435-440.

[15]Knowles CH,Farrugia G.Gastrointestinal neuromuscular pathology in chronic constipation[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2011,25(1):43-57.

[16]Yamamoto T,Watabe K,Nakahara M,etal.Disturbed gastrointestinal motility and decreased interstitial cells of Cajal in diabetic db/db mice[J].J Gastroenterol Hepatol,2008,23(4):660-667.

[17]Zhang H,Xu X,Wang Z,etal.Correlation between gastric myoelectrical activity recorded by multi-channel electrogastrography and gastric emptying in patients with functional dyspepsia[J].Scand J Gastroenterol,2006,41(7):797-804.

Effects of ascending to high altitude on gastric motility, ultrastructure and function of interstitial cell of Cajal in the rats

ZHU Lin, HE Wei*, YANG Shengyue, FAN Xingai, LIU Ruinian, CHEN Lei

(DepartmentofGastroenterology,FourthHospitalofPLA,Xining810007,China;*Correspondingauthor,E-mail:hewei.1971@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the influence of different altitude and duration time on the gastric electrical activities, the ultrastructure and physiological function of ICCs in high altitude-exposed rats.MethodsA total of 130 SD male rats were divided into three groups: low(Xi’an, 400 m), moderate(Xining, 2 260 m) and high altitude(Maduo, 4 300 m) groups. On the basis of duration time after entering the plateau, the moderate and high altitude groups were further divided into six subgroups(n=10 in each group): 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 10 d, and 14 d groups. The gastric electrical activity was recorded in different groups. Immunofluorescence staining and electron microscope were applied to observe the physiological function and ultrastructure of ICC cells in gastric electrical pacing region.ResultsThe amplitude and frequency of gastric electrical activity were the lowest in moderate altitude 5 d group and high altitude 3 d group(P<0.05). The damage in high altitude 3 d group was the most severe(P<0.05). The physiological function and ultrastructure of ICC cells showed the similar changes in gastric electrical pacing region. The gap junctions and organelles of ICC cells were reduced in moderate altitude 5 d group and high altitude 3 d group, and apoptotic bodies were observed under electron microscope, especially in high altitude 3 d group(P<0.05). The c-kit immunofluorescence results showed the same tend of changes.ConclusionThe gastric electrical activity in rats is significantly influenced by high altitude exposure, and the injury is more serious in higher altitude. The ultrastructure and function of ICCs in gastric pacing location are impaired in the same tendency. The results indicate that the ICCs may play an important role in gastric dynamic disorders in high altitude-exposed rats.

Key words:mountain sickness；high altitude；gastric motility；interstitial cell of Cajal；rats

基金項目：青海省(應用)基礎研究基金資助項目(2013-Z-760)

作者簡介：朱琳，男，1979-11生，碩士，主治醫師，E-mail:298567115@qq.com

收稿日期：2016-03-22

中圖分類號：R361

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0505-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.005