辛伐他汀對結締組織生長因子誘導大鼠心肌細胞肥大的影響及其與ERK1/2的關系

劉　慧， 盧少平， 尚福軍， 牛曉琳， 艾永飛， 趙連友

(第四軍醫大學唐都醫院心內科，西安　710038； *通訊作者，E-mail:xnwz0011@sina.com)

辛伐他汀對結締組織生長因子誘導大鼠心肌細胞肥大的影響及其與ERK1/2的關系

劉慧， 盧少平， 尚福軍， 牛曉琳， 艾永飛， 趙連友*

(第四軍醫大學唐都醫院心內科，西安710038；*通訊作者，E-mail:xnwz0011@sina.com)

摘要：目的觀察辛伐他汀對結締組織生長因子(CTGF)誘導大鼠心肌細胞肥大的影響，探討其作用與細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)的關系。方法以培養的新生的SD大鼠心肌細胞為實驗模型，分為對照組(DMEM培養液)、CTGF(50 ng/L)刺激組、CTGF+不同濃度辛伐他汀 (Sim) 組，分別用圖像分析法測定心肌細胞表面積，[3H]-亮氨酸摻入法測定心肌細胞蛋白合成速率，考馬斯亮蘭法測定心肌細胞蛋白含量，蛋白免疫印跡法測定心肌細胞總ERK1/2(t-ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達水平。結果CTGF組的心肌細胞表面積、[3H]-亮氨酸摻入率、心肌細胞蛋白含量和p-ERK1/2表達均顯著高于對照組(P<0.01)；CTGF+不同濃度辛伐他汀(Sim)組的心肌細胞表面積、[3H]-亮氨酸摻入率、心肌細胞蛋白含量和p-ERK1/2表達分別與CTGF組比較均明顯降低(P<0.01)，而且隨著Sim劑量逐漸增加時，這些指標也隨之逐漸下降，除CTGF+10-5mol/L Sim組和CTGF+10-4mol/L Sim組之間的細胞蛋白含量無明顯差異外，各Sim組間差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；且以上各項指標在CTGF+10-4mol/L Sim組與對照組均無顯著差異。t-ERK1/2的表達在各實驗組間均無差異。結論辛伐他汀可劑量依賴性地抑制CTGF誘導的心肌細胞肥大，其作用機制可能與ERK1/2磷酸化有關。

關鍵詞：結締組織生長因子；辛伐他汀；心肌細胞肥大；信號轉導；ERK1/2

心肌細胞肥大是高血壓左室肥厚(LVH)重要的細胞病理學基礎，闡明其發生及調控機制對心血管疾病的防治具有重要意義。許多研究表明，結締組織生長因子(cardiac myocyte hypertrophy,CTGF)是可刺激心臟成纖維細胞增殖，膠原合成增多的生長因子[1,2]。本課題組之前的實驗研究發現，CTGF也具有誘導心肌細胞肥大的作用，且其誘導心肌細胞肥大的機制可能是通過ERK1/2的磷酸化來實現的[3]。他汀類藥物為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑。近年來，他汀類藥物抑制心肌細胞肥大，從而改善心臟重構已成為一個學術界探討課題。辛伐他汀(Sim)對CTGF誘導的心肌細胞肥大有何作用，及其作用的信號轉導機制尚不十分清楚。本研究觀察辛伐他汀對CTGF誘導下心肌細胞肥大的影響及其信號轉導機制，旨在探討心肌細胞肥大的分子生物學機制和影響因素，為辛伐他汀逆轉心肌肥厚提供新的理論依據。

1材料與方法

1．1實驗動物

出生1-3 d的培養的清潔級封閉群SD大鼠，雌雄不拘，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1．2主要實驗藥品、試劑

辛伐他汀純品由由武漢絲寶藥業集團公司提供，CTGF由中國醫學科學院昆明醫學生物學研究所提供，[3H]亮氨酸購自中國原子能研究院同位素研究所，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，DMEM(高糖)購自美國Gibco公司，新生牛血清購自杭州四季青公司，兔抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白多克隆抗體購自武漢博士德公司，兔抗大鼠t-ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體購自美國Upstate公司。LS6500液體閃爍儀購自Beckman公司,電泳儀及凝膠成像系統購自Biorad公司，Leica-Q500細胞圖像分析系統購自德國Leica公司。

1．3實驗分組及干預措施

實驗分為6組：對照組(DMEM培養液)，CTGF刺激組(CTGF加入DMEM培養液中，濃度為50 ng/L，作用24 h), CTGF+不同濃度辛伐他汀(Sim)干預組(10-7mol/L Sim，10-6mol/L Sim，10-5mol/L Sim，10-4mol/L Sim)(在DMEM培養液中分別加入50 μg/L CTGF和不同濃度Sim,作用24小時)。

1．4心肌細胞分離、培養及鑒定

無菌條件下取出新生SD大鼠的心臟，剪去心房及血管，將心室在D-Hanks液中剪碎，以0.08%的胰蛋白酶消化成細胞懸液，過濾，1 000 r/min離心5 min，用含10%新生牛血清的DMEM培養液重懸浮，在5%CO2、37 ℃孵箱差速貼壁90 min后取上清，加入0.1 mol/L的5-溴脫氧尿苷，抑制非心肌細胞的生長。倒置顯微鏡觀察細胞呈梭形、三角形或不規則多邊形，培養24 h后逐漸出現自發性同步搏動，頻率約80-120次/分；免疫組化染色提示α-橫紋肌肌動蛋白免疫組化染色陽性，α-平滑肌肌動蛋白染色陰性，符合心肌細胞的染色特征；從而鑒定所培養細胞為心肌細胞。臺盼藍染色提示本實驗細胞活力大于95%。培養細胞2 d換液一次。試驗中使用的細胞均為原代培養4 d的細胞。

1．5心肌細胞表面積測定

將培養的心肌細胞以4×105/ml密度接種于置入玻片的6孔板中，給予干預因素24 h后，用95%乙醇固定爬片15 min，HE染色。采用Leica-Q500圖像分析系統測定心肌細胞表面積，隨機選取5個視野，每個視野隨機測定5個細胞，取其平均值，結果以μm2表示。

1．6心肌細胞蛋白合成速率的測定

將培養的心肌細胞以4×105/ml接種于24孔培養板，每孔1 ml。給予干預因素后每孔加入預溫至37 ℃的[3H]-亮氨酸(終濃度為3.7×104Bq/ml)繼續培養6 h，用4 ℃PBS洗細胞2次，多頭細胞收集器收集細胞裂解液至玻璃纖維濾膜上，用10%三氯乙酸沖洗，濾膜烘干后置閃爍記數管中，加入閃爍液，以LS6500型液態閃爍計數儀測定放射性。結果以cpm/well值表示。

1．7心肌細胞蛋白含量的測定

將培養的心肌細胞以4×105/ml密度接種于24孔板，給予干預因素24 h后，吸盡培養液棄掉，用PBS洗2次,用0.125%的胰蛋白酶消化收集每孔細胞。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，加0.1 ml SDS(0.1%)，置100 ℃水浴30 min，使細胞裂解。用牛血清白蛋白為標準品制作標準曲線，用考馬斯亮蘭法測定各孔總蛋白含量，根據每孔細胞數，算出每個心肌細胞蛋白含量,單位用ng/cell表示。1．8蛋白免疫印跡法測定t-ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白水平給予干預因素24 h后終止心肌細胞的培養，加細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。取20 μg蛋白加上樣緩沖液煮沸變性5 min。行SDS-PAGE電泳和蛋白轉膜，將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加兔抗大鼠t-ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體(按說明稀釋)，4 ℃孵育過夜。HRP標記的羊抗兔IgG二抗(按1∶10 000稀釋)孵育2 h,ECL發光，在暗室中X片曝光、顯影、定影，顯示特異的蛋白條帶,最后對結果進行吸光度掃描分析。

1．9統計學分析

2結果

2.1不同濃度辛伐他汀對CTGF誘導下心肌細胞表面積、蛋白合成速率、蛋白含量的影響

CTGF刺激組心肌細胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量與對照組比較均顯著增加(P<0.01)；CTGF+不同濃度Sim組的心肌細胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量與CTGF刺激組比較均明顯降低(P<0.01，見表1)，且Sim劑量逐漸增加時，這些指標也隨之逐漸下降，除CTGF+10-5l/L Sim組和CTGF+10-4mol/L之間的細胞蛋白含量無明顯差異外，各Sim組間差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01，見表1)。且當Sim濃度達到10-4mol/L時，以上各指標均較對照組無顯著差異。

表1辛伐他汀對CTGF誘導心肌細胞表面積、蛋白合成速率及蛋白含量的影響

Table 1Effect of simvastatin on CTGF-induced myocardial cell surface, protein synthesis rate and protein contents

組別細胞表面積(μm2)細胞蛋白合成速率(cpm/well)細胞蛋白含量(ng/cell)對照組676.38±90.25926.32±83.560.635±0.072CTGF(50μg/L)組1825.36±173.55ab2300.55±115.47ab1.656±0.216abCTGF+10-7mol/LSim組1530.58±151.58ab1989.36±101.22ab1.206±0.152abCTGF+10-6mol/LSim組1111.46±135.63ab1551.14±102.55ab0.895±0.123abCTGF+10-5mol/LSim組901.18±110.47ab1232.10±93.58ab0.722±0.082bCTGF+10-4mol/LSim組725.24±92.35b1033.46±90.29b0.685±0.065b

與對照組比較，aP<0.01；與CTGF組比較，bP<0.01；細胞表面積和蛋白合成速率中4個Sim組間比較，P<0.01；蛋白含量除CTGF+10-5mol/L Sim組與CTGF+10-4mol/L Sim組間沒有差異，其余Sim組間差異P<0.05或P<0.01

2.2辛伐他汀對CTGF誘導心肌細胞t-ERK1/2和p-ERK1/2表達的影響

CTGF刺激組的心肌細胞p-ERK1/2表達明顯高于對照組，CTGF+不同濃度Sim組心肌細胞p-ERK1/2表達與CTGF刺激組比較均明顯降低(P<0.01)，且Sim劑量增加時，p-ERK1/2表達水平也隨之逐漸下降，各Sim組間差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。且當Sim濃度達到10-4mol/L時，p-ERK1/2表達較對照組無顯著差異。心肌細胞t-ERK1/2的表達在各組沒有明顯的差異(見圖1和表2)。

1.對照組(DMEM培養液組)；2.CTGF(50 g/L)刺激組；3.CTGF+10-7 ol/L Sim組；4.CTGF+10-6 mol/L Sim組；5. CTGF+10-5 mol/L Sim組；6.CTGF+10-4 mol/L Sim組圖1　辛伐他汀對CTGF誘導心肌細胞t-ERK1/2和p-ERK1/2表達的影響Figure 1　Effects of simvastatin on the expression of t-ERK1/2 and p-ERK1/2 in cardiac myocytes induced by CTGF

表2辛伐他汀對CTGF誘導心肌細胞ERK1/2表達的影響(%)

Table 2Effects of simvastatin on the expression of t-ERK1/2 and p-ERK1/2 in cardiac myocytes induced by CTGF (%)

組別t-ERK1/2p-ERK1/2對照組100100CTGF刺激組107.23±15.83220.65±20.69abCTGF+10-7mol/LSim組105.13±13.25176.57±16.47abCTGF+10-6mol/LSim組103.59±13.56143.33±15.23abCTGF+10-5mol/LSim組103.26±14.41120.15±12.65abCTGF+10-4mol/LSim組105.36±12.58108.34±12.79b

與對照組比較,aP<0.01；與CTGF刺激組比較，bP<0.01； p-ERK1/2中除CTGF+10-5mol/L Sim組和CTGF+10-4mol/L Sim組比較，P<0.05，其余Sim組間比較均P<0.01

3討論

左室肥厚是近年來研究熱點，其病理改變主要包括兩方面：一是心肌細胞的肥大；二是細胞外基質沉積增加[4]。目前認為，左室肥厚是心力衰竭、心律失常、心絞痛、急性心肌梗死、猝死心血管事件的獨立危險因素。因此，有關如何有效預防和逆轉左室肥厚及其信號轉導通路的研究，對心血管疾病的防治具有非常重要的作用。

CTGF是Bradham等[5]于1991年在篩選人類臍靜脈內皮細胞互補脫氧核糖核酸(cDNA)文庫時首次發現的,為含有349個氨基酸的肝素結合型蛋白。近年來許多研究證實：CTGF在高血壓、心力衰竭等各種心血管疾病中CTGF表達均明顯增高，并可通過其多種生物學作用參與心肌重塑、心臟纖維化等病變的發生發展[2]。Clerk等[6]研究發現，在內皮素-1等致肥大激動劑誘導的肥大的心肌細胞中，CTGF表達增加，并可持續8-24 h。他汀類藥物為膽固醇抑制劑，近年研究表明，他汀還具有獨立于調脂之外的心血管保護作用，如抗炎、改善血管內皮、穩定斑塊等，同時可抑制血管平滑肌增殖，抑制心肌細胞肥大，從而逆轉左室肥厚[7,8]。我們在本實驗中觀察了CTGF和CTGF+不同濃度Sim對心肌細胞肥大的影響，結果表明，在50 μg/L CTGF刺激下，心肌細胞表面積、蛋白合成速率、蛋白含量較對照組顯著增加，這與本課題組前期實驗研究結果相一致[3]；給予不同濃度Sim干預后，心肌細胞表面積、蛋白合成速率、蛋白含量較CTGF組均明顯降低(P<0.01)，且Sim劑量逐漸增加時，這些指標也隨之逐漸下降,除CTGF+10-5mol/L Sim組和CTGF+10-4mol/L Sim組之間的細胞蛋白含量無明顯差異外，各Sim組間差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01),且當Sim濃度達到10-4mol/L時，以上各指標均較對照組無顯著差異。提示Sim可劑量依賴性抑制心肌細胞肥大，且Sim抑制心肌細胞肥大的理想濃度可能是10-4mol/L。

在心肌細胞肥大的發生發展及逆轉的過程中，可能有多條信號轉導通路共同參與。目前國內研究中，他汀抑制心肌細胞肥大、逆轉左室肥厚的機制有：通過抑制PI3K/PKB途徑而下調蛋白激酶表達[9]；抑制JAK-STAT信號途徑[10]；抑制Ca2+/CaN信號途徑從而抑制細胞內Ca2+濃度[11]；對TLR4基因表達的影響[12]等。是否還有其他分子機制，目前尚在進一步研究中。有人提出，ERK的表達及活化可誘導心肌細胞肥大[13,14]。本課題組之前的研究也發現，CTGF可誘導心肌細胞肥大，其作用可能是通過ERK1/2的磷酸化來實現的[3]。ERK 1/2是ERK1和ERK2的統稱，為絲裂原活化的蛋白激酶MAPKs家族成員之一,是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵。ERK途徑受細胞周期及以及細胞外刺激的調控，是細胞生長、活化與存活等過程的重要信號轉導機制[15]。在本實驗中，給予不同濃度Sim干預后，心肌細胞p-ERK1/2的表達較CTGF組明顯降低，且Sim劑量逐漸增加時，p-ERK1/2的表達也隨之逐漸下降(P<0.01)；各Sim組間差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。且當Sim濃度達到10-4mol/L時，p-ERK1/2較對照組無顯著差異。而t-ERK1/2表達在各實驗組間變化則不明顯。心肌細胞在生理狀態下即有t-ERK1/2表達，根據實驗各組t-ERK1/2無明顯變化但p-ERK1/2的卻有顯著變化，進一步提示ERK1/2在磷酸化后才介導Sim抑制CTGF誘導的心肌細胞肥大的作用,這種抑制作用具有劑量依賴性，且Sim抑制心肌細胞肥大的理想濃度可能是10-4mol/L。

綜上所述，辛伐他汀可劑量依賴性地抑制CTGF誘導心肌細胞肥大，從而參與抑制心臟重構的發生發展，而且該作用機制可能與其抑制ERK1/2的磷酸化有關，這就為辛伐他汀抑制心肌重構提供了進一步的依據。但辛伐他汀抑制CTGF誘導的心肌細胞肥大還有無其他信號轉導機制，有待于進一步研究。

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Effects of simvastatin on hypertrophic cardiac myocytes induced by connective tissue growth factor and its relation with ERK1/2

LIU Hui, LU Shaoping,SHANG Fujun, NIU Xiaolin, AI Yongfei, ZHAO Lianyou*

(DepartmentofCardiology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China；*Correspondingauthor,E-mail:xnwz0011@sina.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of simvastatin on cardiac myocytes hypertrophy induced by connective tissue growth factor(CTGF) and its relationship with ERK1/2.MethodsThe neonatal Sprague-Daley(SD) rats cardiomyocytes were divided into six groups: control group(cultured with DMEM),CTGF(50 ng/L) group and CTGF+different concentrations of simvastin groups.Image analysis system was used to measure the cell surface area.[3H]-leucine incorporation method was used to measure protein synthesis rate of myocytes. Coomassie brilliant blue method was used to measure contents of cardiac myocytes protein.Western blot was used to study the protein expression levels of t-ERK1/2 and p-ERK1/2.ResultsCompared with control group, the myocardial cell surface area,[3H]-leucine incorporation rate, myocardial cell protein contents and p-ERK1/2 expression were significantly increased in CTGF group(P<0.01). The myocardial cell surface area,[3H]-leucine incorporation rate, myocardial cell protein and P-ERK1/2 expression in CTGF+different concentrations of Sim groups were significantly lower than in CTGF group(P<0.01), and these indexes were also gradually decreased with the increase of dose of Sim.The content of cardiac myocytes proteins was significantly different between different concentrations groups(P<0.05,P<0.01) except beween CTGF+10-5mol/L Sim group and CTGF+10-4mol/L Sim group. The above indexes showed no difference between CTGF+10-4mol/L Sim group and control group. The expression of t-ERK1/2 showed no difference among six groups.ConclusionSimvastatin could inhibit CTGF-induced myocyte hypertrophy in a dose dependent manner, which may be related to ERK1/2 phosphorylation.

Key words:connective tissue growth factor;simvastatin;cardiac myocyte hypertrophy；signal transduction;ERK1/2

作者簡介：劉慧，女，1978-09生，碩士，主治醫師，E-mail：wenbei0921@163.com

收稿日期：2016-01-28

中圖分類號：R363

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)06-0489-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.06.001