苗藥頭花蓼含藥血清對巨噬細胞釋放炎癥因子的影響*

徐　丹， 趙菲菲， 楊　馨， 劉　俊， 李　靖， 徐國波， 廖尚高*

(1.貴州醫科大學 藥學院 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽　550004)

·基礎研究·

苗藥頭花蓼含藥血清對巨噬細胞釋放炎癥因子的影響*

徐丹1**， 趙菲菲1，2， 楊馨1，2， 劉俊1， 李靖1， 徐國波1， 廖尚高1***

(1.貴州醫科大學 藥學院 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討苗藥頭花蓼對脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)釋放炎癥因子的影響。方法： 制備苗藥頭花蓼水提醇沉提取物的含藥血清( PCWEPS )， 采用10 μg/L脂多糖(LPS)建立RAW264.7細胞炎癥損傷模型，Griess試劑法檢測細胞上清液中一氧化氮(NO)的含量，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的表達，實時熒光定量PCR法(Real Time-PCR)檢測TNF-α及IL-6 mRNA的表達水平，Western blot 法檢測NF-κB通路中I-κBα蛋白和p-I-κBα蛋白表達水平。結果： 與模型組比較，3種給藥劑量的PCWEPS均顯著抑制LPS誘導的RAW264.7 細胞釋放NO，TNF-α和IL-6 (P<0.001)；PCWEPS能夠顯著降低TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平(P<0.001)，下調p-I-κBα蛋白的表達(P<0.001)，降低NF-κB通路中I-κBα蛋白的磷酸化。結論： 頭花蓼抑制巨噬細胞中炎癥因子釋放，可能與抑制NF-κB通路中I-κBα的磷酸化有關。

[關鍵詞]植物藥； 頭花蓼； 單核巨噬細胞； 炎癥因子； NF-κB通路

頭花蓼(polygonumcapitatumBuch-Ham. ex D. Don)為蓼科蓼屬植物頭花蓼的干燥全草具有利尿通淋之功效，臨床上主要用于泌尿系統感染疾病的治療[1]。研究表明，頭花蓼水提物及70%乙醇提取物具有顯著的抗炎活性[4]，其中的三萜、甾體和黃酮類化合物與抗炎活性密切相關[5]，但頭花蓼的抗炎機制尚不明確。活化的單核-巨噬細胞是炎癥反應中細胞因子的重要來源，當受到刺激時，單核細胞會轉移至血管外組織成為巨噬細胞，激活后的巨噬細胞產生一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)等細胞因子，對機體環境中的內皮細胞、上皮細胞和間質細胞產生影響，并對宿主的免疫反應、組織重建修復等發揮重要作用[6-7]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是誘導巨噬細胞釋放炎癥介質的有效物質，誘導巨噬細胞釋放炎癥因子模型被廣泛用于抗炎藥物的篩選評價[8-9]。本研究通過考察頭花蓼水提醇沉提取物含藥血清(PCWEPS)對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放炎癥因子的影響，探討頭花蓼的抗炎作用及其作用機制。

1材料與方法

1.1試藥與試劑

頭花蓼藥材(貴州省施秉縣頭花蓼GAP種植基地),陽性對照藥醋酸地塞米松磷酸鈉注射液(貴州光正制藥有限責任公司產品，國藥準字H52020793，批號130315)。DMEM高糖培養基(Gibco公司，批號 8114410)，胎牛血清(Hyclone公司，批號 NZE1145)，LPS(Sigma公司，批號102M4017V)，MTT(Sigma公司，批號 M1959)；磺胺(批號 30172216)，N-(1-萘基)-乙二胺(批號 80088013)，DMSO(批號 302A0323)，均購于國藥集團。小鼠TNF-α 、IL-6ELISA試劑盒(RayBio公司，批號 0313150430、0313150413)，AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(康寧生命科學有限公司，批號 12213KD1)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，批號 AK2802)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，批號 AK6101)，引物(上海生物工程公司)，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(碧云天，批號 P0012AC)，哺乳動物蛋白抽提試劑盒(康為世紀，批號 CW0889)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio，批號 PC0020)，TRIS(Solarbio，批號 1128Q0713)，Glycine(Sigma，批號 WXBB6513V)，SDS(Sigma，批號 L-5750)，I-κBα單克隆抗體(美國abcam公司，批號 GR181745-8)，p-I-κBα單克隆抗體(美國abcam公司，批號 GR98748-15)，羊抗兔IgG抗體(美國abcam公司，批號 GR209629-7)。

1.2動物與分組

Wistar大鼠30只，雌雄各半，體質量(200±20)g，SPF級，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(黔)2012-0001。根據灌胃劑量將小鼠隨機分為18、54、162 g/(kg·d)頭花蓼水提醇沉提取物組(PCWEP，分別對應頭花蓼單方制劑熱淋清顆粒臨床劑量的3、9和27倍)，每組10只。灌胃前12 h禁食不禁水，尾靜脈采集空白血，然后按不同劑量灌胃PCWEP，2次/d，連續4 d，末次給藥后90 min尾靜脈取血[10]。以2 000 r/min，4 ℃離心10 min分離上層血清，合并同組血清，過濾除菌，分裝，-20 ℃保存備用。

1.3方法及考察指標

1.3.1RAW264.7細胞活性RAW264.7細胞培養于含10%胎牛血清，100 mg/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM細胞培養液中，置于溫度為37 ℃，5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以2×105個/mL 的濃度接種于96孔培養板中，每孔體積100 μL，細胞培養24 h后，棄去上清液。實驗分為對照組：無大鼠血清的培養基，實驗組：不同體積分數(0.5%、1.0%、1.5%及2.0%，V/V)的空白血清或PCWEPS，培養24 h后，每孔加入2.5 g/L MTT 10 μL，繼續孵育4 h，吸棄上清液，加入DMSO 100 μL，振蕩10 min后，在酶標儀上于490 nm波長處測定吸光度(A)，每組設6個平行孔。按照公式計算：細胞存活率=實驗組A/對照組A平均值×100%。

1.3.2RAW264.7細胞釋放NO的檢測前期研究發現，當空白血清體積(V/V)為1.5% 時，既不影響RAW264.7細胞的生長，也不影響LPS刺激所產生的NO釋放的檢測，因此確定實驗中含藥血清的添加體積(V/V)為1.5%。參照1.3.1項，實驗分為對照組(無大鼠血清的培養基)、模型組(終濃度為10 μg/L的LPS溶液)、DEXA組(終濃度為50 mg/L的地塞米松和10 μg/L的LPS混合液)及不同劑量PCWEPS組(終濃度為10 μg/L的LPS和體積分數(V/V)為1.5%的不同劑量含藥血清，與細胞共培養，每組設6個平行孔)。計算NO釋放量。

1.3.3RAW264.7細胞釋放TNF-α及IL-6的檢測參照1.3.2項，收集RAW264.7細胞上清液，每組設6個平行孔，TNF-α和IL-6的釋放量采用ELISA試劑盒提供的方法進行測定，根據標準曲線計算TNF-α和IL-6 的釋放量。

1.3.4RAW264.7細胞TNF-α和IL-6 mRNA表達水平取對數生長期RAW264.7細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以2×105個/mL的濃度接種于6孔培養板中，每孔體積2 mL，細胞培養24 h后，棄去上清液。參照1.3.2項，培養24 h后，采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取總RNA，TaKaRa試劑盒反轉錄為cDNA，按照SYBR Green試劑盒說明擴增TNF-α及IL-6目的條帶，每組設3個平行孔。引物由上海生物工程公司合成，TNF-α上游引物5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3′，下游引物5′-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3′；IL-6上游引物5′-CTGCAAGAGACTTCCAYCCAG-3′，下游引物5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′。內參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物，上游引物5′-AGTATGACTCCACTCACGGCAAAT-3′，下游引物5′-GTCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3′。根據2-△△Ct，以GAPDH為參照，進行TNF-αmRNA及IL-6 mRNA相對定量分析。

1.3.5RAW264.7細胞I-κBα和p-I-κBα蛋白表達參照1.3.4項，RAW264.7細胞培養6 h后，哺乳動物蛋白抽提試劑盒提取蛋白樣本，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后定量，每孔為40 μg上樣。采用兩步法進行實驗，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，通過蛋白快速轉印儀將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)上，TBST洗滌3次，5%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，TBST洗滌3次，用封閉液分別按1∶1 000和1∶10 000稀釋I-κBα和p-IκBα抗體，室溫震蕩孵育2 h， 4 ℃過夜，TBST洗滌3次，用TBST按1∶5 000稀釋羊抗兔IgG抗體，室溫震蕩孵育2 h，TBST洗滌3次，用ECL超敏發光液顯影，于凝膠成像儀中曝光并記錄結果，使用Quantity One v4.62軟件對條帶進行定量分析，并以β-actin為內參標化蛋白電泳條帶的灰度值。

1.4數據分析

2結果

2.1RAW264.7細胞活性

當空白血清及不同劑量PCWEPS體積分數(V/V)為0.5%～1.5%作用于RAW264.7細胞24 h時，與對照組比較，RAW264.7細胞存活率無顯著性差異，提示在此體積范圍內空白血清及含藥血清對于RAW264.7細胞本身的生長無顯著影響；超過此添加量，隨著血清體積的增加，RAW264.7細胞的生長受到顯著影響。為有效反映藥物的藥效，在后續實驗中，血清體積分數(V/V)設定為1.5%。見表1。

2.2對RAW264.7細胞釋放NO的影響

與對照組比較，模型組顯著刺激RAW264.7細胞釋放NO(P<0.001)；與模型組比較，不同劑量的PCWEPS均能抑制RAW264.7細胞釋放NO，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見表2。

2.3RAW264.7細胞釋放TNF-α及IL-6

與對照組比較，模型組顯著刺激RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6(P<0.001)；與模型組比較，不同給藥劑量的PCWEPS均能抑制RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見表3。

2.4RAW264.7細胞TNF-α，IL-6 mRNA表達

與對照組比較，模型組顯著提高了RAW264.7細胞TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平(P<0.001)；與模型組比較，不同給藥劑量的PCWEPS均能降低RAW264.7細胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見表4。

表1　空白血清及PCWEPS對細胞活性的影響

(1)與對照組比較，P<0.001

表2　PCWEPS對RAW264.7細胞釋放NO的影響

(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

表3　PCWEPS對RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6的影響

(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

表4　PCWEPS對RAW264.7細胞TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表達的影響

(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

2.5RAW264.7細胞I-κBα蛋白及p-I-κBα蛋白表達

以β-actin作為內參照，RAW264.7細胞經LPS干預6 h后，與對照組比較，模型組p-I-κBα蛋白表達顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，各給藥組含藥血清均能抑制RAW264.7細胞p-I-κBα蛋白的表達，且呈劑量依賴性(P<0.001)。見圖1，表5。

圖1　PCWEPS對RAW264.7細胞I-κBα蛋白表達的影響Fig.1　Effect of PCWEPS on I-κBα protein expressions in RAW264.7 cells 表5　PCWEPS對RAW264.7細胞I-κBα蛋白表達的影響

組別p-I-κBα/I-κBα對照組0.33±0.01模型組1.94±0.02(1)PCWEPS[g/(kg·d)] 181.52±0.02(2) 541.05±0.03(2) 1620.64±0.01(2)

(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與模型組比較，P<0.001

3討論

頭花蓼是貴州苗族民間常用藥材，是治療泌尿系統感染的良藥，具有突出的抗菌和抗炎作用。由于其化學成分復雜，因此在本研究中，采用頭花蓼含藥血清，研究其對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子的影響，代替中藥粗提物作為藥物載體既避免了藥物的物理化學性質對實驗結果的影響，又能夠更好的模擬藥物在體內發揮作用的過程[11]。巨噬細胞是機體炎癥反應的一個重要參與者，在被感染過程中，被激活的巨噬細胞能釋放致炎因子NO，IL-6和TNF-α等炎癥因子，促進組織的重建修復；但過量炎癥因子的釋放會加重炎癥反應，導致組織損傷、并產生病理變化[12-13]。脂多糖是革蘭氏陰性菌菌壁的主要活性成分，是誘導巨噬細胞釋放炎癥介質最強烈、最有效的激活物，在革蘭氏陰性菌感染中發揮重要作用[14]。因此，抑制巨噬細胞中NO，IL-6和TNF-α等致炎因子的過度釋放對抗炎治療意義重大。本研究結果證實，LPS誘導巨噬細胞炎癥因子釋放增加，PCWEPS能顯著降低TNF-α和IL-6 mRNA的水平，并抑制巨噬細胞中NO，TNF-α和IL-6的釋放。

NF-κB是早期核轉錄因子，在靜息狀態下，NF-κB和I-κB形成復合體存在于胞漿中。I-κB有多種亞型，包括I-κBα、I-κBβ、I-κBγ、I-κBδ、I-κBε、p100、p105和Bcl-3，其中I-κBα尤為關鍵，它在核內對NF-κB的抑制作用最強[15]，因此在本研究中選取I-κBα為考察指標，在細菌感染下，LPS等外源性誘導劑使I-κB激酶(IKK)活化，活化后的IKK將I-κB磷酸化(生成p-I-κBα)，使NF-κB和I-κB解離，游離的NF-κB迅速移位到細胞核，啟動基因如TNF-α，iNOS的轉錄和表達，導致炎癥的發生[16]。本研究發現，LPS能夠通過顯著促進RAW264.7細胞中I-κBα的磷酸化從而激活NF-κB信號通路，但PCWEPS能夠有效地抑制這一過程，提示頭花蓼含藥血清能夠通過抑制I-κBα的磷酸化調控NF-κB信號通路，進而抑制炎癥因子NO，TNF-α及IL-6的釋放。

綜上，頭花蓼的抗炎作用可能與其調控NF-κB信號通路，降低TNF-α和IL-6 mRNA的水平，抑制炎癥因子NO，TNF-α和IL-6的釋放有關。研究結果為深入探討頭花蓼在泌尿系統感染中的作用奠定了基礎，也為頭花蓼的進一步開發應用提供了依據。

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(2016-03-11收稿，2016-05-28修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

Effect of the Drug-containing Serum of Miao MedicinePolygonumcapitatumon Inflammatory Cytokines in Macrophages

XU Dan1,2, ZHAO Feifei1,3, YANG Xin1,3, LIU Jun1,2, LI Jing1,2, XU Guobo1,2, LIAO Shanggao1,2

(1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicinesandTCM,MinistryofEducation,Guiyang550004,Guizhou,China;3.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Miao medicine Polygonum capitatum on inflammatory cytokines released from Lipopolysaccharide (LPS)-induced monocyte macrophage (RAW264.7) in mice. Methods: The drug-containing serum (PCWEPS) of Polygonum capitatum was prepared by classical water extraction and alcohol precipitation method. The inflammatory damage model of RAW264.7 cells was established by 10 g/L lipopolysaccharide (LPS). NO content was detected by the Griess assay, the protein expression of TNF-α and IL-6 expression were detected by ELISA in the cell culture supernatant, the mRNA expression of TNF-α and IL-6 were determined by Real Time-PCR, and the protein expressions of I-κBα and p-I-κBα in NF-κB pathway were measured by Western blot. Results: Compared with the model group, the PCWEPS of 3 kinds of different doses could significantly inhibit the release of NO, TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells (P<0.001). In addition, PCWEPS could significantly decrease the mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 (P<0.001), down-regulated the protein expression of p-I-κBα protein (P<0.001) and decrease phosphorylation of I-κBα protein in NF-κB pathway (P<0.001). Conclusion: P. capitatum can inhibit the inflammatory cytokines release from the macrophage cells, and the mechanism may be related to its inhibition of phosphorylation of I-κBα protein in NF-κB pathway.

[Key words]plant medicine; Polygonum capitatum; mononuclear macrophage; inflammatory factors; NF-κB pathway

*[基金項目]國家自然科學基金(81160516；81560570；81260688)

[中圖分類號]R965.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0635-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.004

**貴州醫科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:lshangg@163.com

網絡出版時間：2016-06-1網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1725.050.html