新型蛋白酶體抑制劑MLN2238對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

郭　錳　萬里新　張成輝　徐　赟

(南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南　南陽　473000)

新型蛋白酶體抑制劑MLN2238對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

郭錳萬里新張成輝徐赟

(南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南南陽473000)

〔摘要〕目的探討新型蛋白酶體抑制劑MLN2238對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。方法取對數(shù)生長期胃癌細(xì)胞系 BGC-823和SGC-7901，按照MLN2238終濃度0、25、50、75、100 nmol/L分為5組，處理24、48、72 h后采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測各孔吸光值并計算存活率以評價MLN2238對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用；處理48 h后經(jīng)膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)雙標(biāo)或PI標(biāo)記后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的變化。結(jié)果相同作用時間(24、48或72 h)下，隨著MLN2238濃度的增加，MLN2238處理后BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的存活率降低(P<0.05)；相同MLN2238濃度(25、50、75或100 nmol/L)情況下，除100 nmol/L MLN2238作用24 h和48 h的BGC-823細(xì)胞存活率間無統(tǒng)計學(xué)差異外(P>0.05)，隨MLN2238作用時間的延長，MLN2238對BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用也基本呈遞增趨勢(P<0.05)；MLN2238處理BGC-823、SGC-7901細(xì)胞48 h后，除75、100 nmol/L MLN2238作用BGC-823細(xì)胞各周期細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P>0.05)，隨MLN2238濃度的增加，BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例均升高，S、G2/M期細(xì)胞比例降低，且MLN2238的促凋亡效應(yīng)和促細(xì)胞周期G0/G1期阻滯作用呈濃度依賴性(P<0.05)。結(jié)論MLN2238可抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及G0/G1期阻滯，MLN2238的以上作用與作用時間和作用濃度有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕MLN2238；胃癌細(xì)胞；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

目前蛋白酶體已成為一個有效的抗癌治療靶點(diǎn)〔1，2〕。MLN2238是一種口服活性蛋白酶體抑制劑，為第二代蛋白酶體抑制劑〔3〕。有研究表明，MLN2238有較為廣譜的強(qiáng)抗腫瘤作用，不僅在體外可抑制腫瘤細(xì)胞株，而且在前列腺癌裸鼠移植瘤上亦有較好的抗癌效果〔4〕。目前MLN2238對胃癌細(xì)胞是否有抑制作用尚不清楚，本研究旨在探討MLN2238對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑胃癌細(xì)胞系 BGC-823、SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，新型蛋白酶體抑制劑MLN2238購自美國Selleck公司，青霉素、鏈霉素購于北京索萊寶科技有限公司，胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Hyclone公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco BRL公司，二甲亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)及碘化丙錠(PI)購自美國Sigma公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)方法復(fù)蘇于液氮中保存的BGC-823、SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，將CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為5%，每2～3天換液一次，待培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測細(xì)胞增殖情況采用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期BGC-823、SGC-7901細(xì)胞后加入新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基配制單細(xì)胞懸液，以每孔1×104個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200 μl，常規(guī)條件培養(yǎng)24 h后按照MLN2238終濃度0、25、50、75、100 nmol/L分為5組，每組設(shè) 3個復(fù)孔，處理24、48、72 h后向每孔加入MTT溶液，避光反應(yīng)4 h后，采用150 μl DMSO溶液替換MTT溶液，在490 nm波長下檢測各孔吸光值(A490)并計算存活率以評價MLN2238對胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。存活率(%)=(加藥組A490/對照組A490)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期檢測將密度為3×106/ml的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，按照MLN2238終濃度0、25、50、75、100 nmol/L分為5組，每組設(shè) 3個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并等分為兩部分：(1)經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗及Binding Buffer懸浮后，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光反應(yīng)15 min后上流式細(xì)胞儀測定檢測細(xì)胞凋亡率；(2)加入PI上流式細(xì)胞儀測定檢測細(xì)胞周期。以上操作均嚴(yán)格依據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MLN2238處理對胃癌細(xì)胞增殖的影響相同作用時間(24、48或72 h)下，隨著MLN2238濃度的增加，MLN2238處理后BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的存活率降低(P<0.05)；相同MLN2238濃度(25、50、75或100 nmol/L)情況下，除100 nmol/L MLN2238作用24 h和48 h的BGC-823細(xì)胞存活率間無統(tǒng)計學(xué)差異外(P>0.05)，隨MLN2238作用時間的延長，MLN2238對BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制作用也基本呈遞增趨勢(P<0.05)。見表1。

2.2MLN2238處理對胃癌細(xì)胞凋亡的影響MLN2238處理BGC-823、SGC-7901細(xì)胞48 h后，隨著MLN2238濃度的增加，BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的凋亡率均升高，且MLN2238的促凋亡效應(yīng)呈濃度依賴性(P<0.05)。見表2。

2.3MLN2238處理對胃癌細(xì)胞周期的影響MLN2238處理BGC-823、SGC-7901細(xì)胞48 h后，除75、100 nmol/L MLN2238作用BGC-823細(xì)胞各周期細(xì)胞比例的差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P>0.05)，隨MLN2238作用濃度的升高，BGC-823、MLN2238作用后的G0/G1期細(xì)胞比例升高，S、G2/M期細(xì)胞比例降低，MLN2238對BGC-823、SGC-7901細(xì)胞周期G0/G1阻滯作用基本上呈遞增趨勢(P<0.05)。見表3。

表1　MLN2238處理后BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的存活率變化

與0 nmol/L比較：1)P<0.05；與25 nmol/L比較：2)P<0.05；與50 nmol/L比較：3)P<0.05；與75 nmol/L比較：4)P<0.05；下表同

表2　不同濃度MLN2238處理胃癌細(xì)胞48 h后的凋亡率

表3　MLN2238處理BGC-823、SGC-7901細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期分布情況

3討論

蛋白酶體抑制劑硼替佐米和卡非佐米在臨床試驗(yàn)的成功運(yùn)用，表明蛋白酶體抑制劑在抗腫瘤治療中的重要作用〔5〕。此外，包括Marizomib(又名NPI-0052)、雷公藤紅素和EGCG等天然產(chǎn)物在內(nèi)的多種蛋白酶體抑制劑已進(jìn)行了臨床或臨床前階段〔6〕。MLN2238目前已進(jìn)入了臨床I期試驗(yàn)，研究表明MLN2238具有較強(qiáng)的抗腫瘤效果，可增強(qiáng)第一代蛋白酶體抑制劑或其他化療藥物的抗腫瘤效果〔3，4〕，同時對利妥昔單抗化療耐藥的B細(xì)胞淋巴瘤也有較好的殺滅效果〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)MLN2238可抑制胃癌BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的增殖，且該抑制作用呈濃度和時間依賴性，與Wei等〔4〕在前列腺癌細(xì)胞中報道的結(jié)果一致，表明抑制蛋白酶體活性可能成為多種惡性腫瘤的治療策略。

蛋白酶體底物在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程中起重要作用，而阻斷蛋白酶體活性可導(dǎo)致蛋白酶體底物的積累，繼而影響細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程〔8，9〕。本研究發(fā)現(xiàn)MLN2238可升高胃癌BGC-823、SGC-7901細(xì)胞的凋亡率，通過直接證據(jù)表明MLN2238可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。有研究表明MLN2238可調(diào)控促凋亡蛋白p53 或NOXA的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)多種惡性腫瘤的凋亡〔7〕。因此本研究推測MLN2238可能也通過誘導(dǎo)p53 或NOXA表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。此外，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是胃癌惡性的主要表現(xiàn)之一〔10，11〕。本研究進(jìn)一步表明MLN2238可抑制胃癌細(xì)胞周期的進(jìn)程，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。但目前MLN2238影響胃癌細(xì)胞周期的機(jī)制尚不清楚，推測可能與調(diào)控G1向S期轉(zhuǎn)化的細(xì)胞周期蛋白表達(dá)有關(guān)。

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〔2015-08-10修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2621-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.024

第一作者：郭錳(1981-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事惡性腫瘤的介入治療研究。