七帶石斑魚神經壞死病毒的RT—LAMP檢測方法

劉濱++劉新富++曾霖++孟振++劉江春

摘 要：報道了一種可以快速、靈敏地檢測七帶石斑魚神經壞死病毒（NNV）的逆轉錄環介導等溫擴增方法（RT-LAMP）。該方法參考赤點石斑魚NNV病毒的主衣殼蛋白（MCP）基因的保守序列，設計1對引物克隆出七帶石斑魚NNV的基因序列，利用Primer Explorer V4 軟件設計了3對針對所克隆NNV基因序列的特異性引物，建立了RT-LAMP的反應體系，并分別對反應系統的引物濃度、反應溫度和時間進行了優化，形成了七帶石斑魚NNV病毒RT-LAMP檢測技術。實踐應用結果表明，在63 ℃的最佳反應溫度下，采用RT-LAMP檢測技術經過45 min就能完成一次檢測，準確率達到100 %。本研究建立的RT-LAMP檢測NNV技術設備要求簡單，為七帶石斑魚等石斑魚無NNV受精卵和仔稚魚的生產現場檢測和篩選提供了一種方便、靈敏的檢測方法。

關鍵詞：七帶石斑魚；神經壞死病毒；檢測；RT-LAMP

中圖分類號：S941 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.006

Abstract：A rapid and sensitive technique for detecting of Nervous Necrosis Virus in seven-band grouper was developedthrough reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP） method. A set of six specific primers were designed based on MCP gene of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus （ RGNNV） using Primer Explorer V3 software. The parameters of primer concentration， reaction time and temperature were optimized.The RT-LAMP method established in this article was applied to detect nervous necrosis virus of seven-band grouper larvae in the fish farming field， the results showed that the sensitivity of RT-LAMP method was consistent with the nested RT-PCR method， as well as the detection result of RT-LAMP method could be easily determinate，andthe detection time was short， which can be completed within 2 hours. The RT-LAMP assay developed in this article wasvery suitable for rapid diagnosis of early NNV infection of seven-band grouper larvae in fish farming field.

Key words： seven-band grouper （Epinephelus septemfasciatus）； nervous necrosis virus （ NNV）； detection； reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）

七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我國沿海分布緯度最高的石斑魚種類，除了具有個體大、生長速度快和經濟價值高等特點外，對低溫的耐受能力較強，生存水溫9～34 ℃，攝食水溫12～32 ℃，有“冷水石斑”之稱，被認為是東北亞溫帶海域網箱養殖理想海水魚類品種之一[1]，其苗種繁育技術的突破，可以緩解我國東海北部和黃渤海沿岸網箱適養魚類品種缺乏的問題，因此備受業界重視。但是盡管國內外研究多年，七帶石斑魚的苗種繁育技術始終不能穩定，在所面臨的技術瓶頸中，神經壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）造成的早期苗種死亡率居高不下是目前最亟待解決的關鍵問題。

病毒性神經壞死病（viral nervousnecrosis，VNN）是造成多種海水魚類早期發育階段大量死亡的諾達病毒科（Nodaviridae）的一種小RNA病毒[2]，對石斑魚的危害尤為嚴重，常常造成90%以上的仔稚魚死亡。為了明析NNV的傳播途徑和研發出相應的預防技術，目前國內外研究學者已經開發出了多種NNV檢測技術，如原位雜交、免疫組織化學方法、熒光抗體技術、細胞培養、ELISA、逆轉錄酶鏈式聚合反應（RT-PCR）和實時定量PCR等方法[3-7]。目前在生產實際中較為有效的檢測手段均建立在神經壞死病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的PCR擴增基礎之上，但仍然存在操作繁瑣、周期長、需要專用儀器設備等缺點，無法滿足實際生產中快速、敏感、準確的檢測需求。

環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸片段擴增技術，該技術由日本學者Notomi等于2000 年首先開發，其核心由4條引物（2條外引物和2條內引物）和一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）組成，原理是通過使鏈置換DNA的合成不停地自我循環以到達快速高效擴增的目的[8]。LAMP技術在恒溫（60～65 ℃）條件下進行核酸擴增，可以通過肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀或加入染料觀察顏色變化[9]判定結果。Nagamine K等[10]于2002年通過在4條引物的基礎上添加了2條環引物LF/LB，能夠明顯加快反應速度，提高擴增效率。由于LAMP技術具有反應快速、操作簡便、成本低、結果易判定等優點，目前已經被成功用于檢測魚類的諸多致病病毒，如彈狀病毒、虹彩病毒、病毒性出血敗血癥病毒和呼腸孤病毒等[11-15]。

本研究在克隆出七帶石斑魚神經壞死病毒（SGNNV）核酸序列的基礎上，建立了基于環介導等溫擴增技術的七帶石斑魚神經壞死病毒LAMP檢測方法，以期為今后在七帶石斑魚養殖產業中進行現場、即時的高效病毒檢測提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 生物材料 2012年于萊州明波水產有限公司采集的8份表現病毒性神經壞死癥狀的七帶石斑魚苗種和2份健康苗種；所有發病苗種均通過陳信忠等發表的RT-PCR方法檢測確定后于-70 ℃保存備用。

1.1.2 病毒RNA 取發病七帶石斑魚的腎、脾、腦等組織混合勻漿，提取病毒RNA參照TRIzol Reagent（Invitrogen）使用方法，從100 mg組織中提取總RNA，-70 ℃保存備用；石斑魚虹彩病毒（SIGV）序列為筆者根據Genbank中收錄的石斑魚虹彩病毒（ID：AY621625）進行體外合成后于本實驗室保存。

1.1.3 試劑與儀器 Bst DNA Polymerase和10×Thermo Pol buffer 購自紐英倫生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；Premix Taq、DL2000 DNA marker、dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自臺灣生工；SYBR Green Ⅰ購自廈門百維信公司；甜菜堿（分析純）購自美國Sigma公司；瓊脂糖購自臺灣生工；BIO-RAD MyCycler梯度PCR儀，恒溫金屬浴及冷凍離心機等儀器均為國產。

1.2 方 法

1.2. 七帶石斑魚NNV病毒序列鑒定 根據Genbank已報道的赤點石斑魚神經性壞死病毒MCP基因序列，進行序列比對后選取最為保守的中間部分設計引物NNV-F和NNV-R，引物序列見表1。以提取的2 μL總RNA為模板、NNV-R為引物，反轉錄合成cDNA。以2 μLcDNA為模板、NNV-F和NNV-R為引物，使用Premix Taq進行常規PCR擴增，反應體系終體系25 μL。PCR程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，46 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環35次；72 ℃延伸10 min，反應結束后對PCR產物進行電泳檢測。其余PCR產物經試劑盒回收后送博尚生物技術有限公司進行直接測序，測序結果經Blast程序與Genbank中收錄的石斑魚神經壞死病毒MCP基因序列進行比對確認。

1.2.2 LAMP引物設計 采用Primer Explorer V4軟件（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）針對七帶石斑魚神經性壞死病毒MCP基因序列設計6條引物，依次為正向內引物（FIP）、反向內引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向環引物（LF）及反向環引物（LB），由博尚生物技術有限公司合成引物，引物序列見表1。

1.2.3 反應體系建立及優化 建立的RT-LAMP反應體系由2.5 μL10×ThermoPol buffer，1.6 μmol·L-1 FIP、BIP，0.2 μmol·L-1 F3、B3，0.8 μmol·L-1 L F、LB，2 mol·L-1 Betaine、4 μL10 mmol·L-1 dNTP，6 mmol·L-1 MgSO4，0.5 μL 200 U Reverse Transcriptase MMLV（TaKaRa），1 μL 8U Bst DNA聚合酶（New England Biolabs），0.5 μL 40 U Ribonuclease inhibitor（TaKaRa）和2 μL模板組成。為優化反應溫度，將經過簡短離心混勻后的反應混合物分別在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃反應1 h后，再經過82 ℃10 min終止反應。為測定環引物對反應時間的影響，分別采用4條引物（FIP，BIP，F3，B3）和6條引物（FIP，BIP，F3，B3，LF 和LB）的反應體系，選擇63 ℃的反應溫度，分別反應25，35，45，55，60，65，75，85，95 min，再經過82 ℃10 min終止反應。隨后對不同反應溫度和不同反應時間下的擴增產物進行凝膠電泳法及熒光染料法檢測。在凝膠電泳檢測中，如果出現典型的梯形條帶即表明發生了擴增反應；在SYBR GREENⅠ熒光染料法檢測中如果反應體系顏色變綠，則說明發生擴增反應；如果反應體系顏色依舊為橙色，則說明未發生擴增反應。

1.2.4 特異性分析 分別取神經壞死病毒和虹彩病毒的核酸樣本為模板進行LAMP方法檢測，并以水作為模板設置空白對照。分別采用瓊脂糖凝膠電泳法及SYBR GreenⅠ法熒光染料法檢測反應結果，分析方法的特異性。

1.2.5 現場檢測結果 在養殖現場對10尾待檢的石斑魚，開展了NNV病毒的LAMP方法檢測，在檢測過程中，分別以NNV RNA和水為模板作為陽性對照和空白對照。同時采用PCR方法與LAMP的檢測結果進行比較。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系的建立

2.1.1 反應溫度的優化LAMP 反應在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃均有擴增，并且擴增產物亮度比較接近，說明該反應體系中的引物設計比較理想，反應條件具有比較好的寬容性，能夠保證反應體系充分有效擴增。在所有的溫度梯度中63 ℃下的產量相對更高，因此，可確定最優的LAMP反應溫度為63 ℃，電泳結果及SYBR GreenⅠ檢測結果見圖1。

2.1.2 反應時間的優化 當反應體系中加入環引物時，LAMP反應45 min就可觀察到明顯的擴增，而在無環引物時，在反應時間到95 min時仍無明顯的擴增產物出現（圖2）。表明在反應體系中加入環引物能夠顯著地縮短反應時間。為了保證低濃度的樣本能夠充分反應并得到準確地檢測，采用了60 min作為本LAMP方法的反應時間。