減毒單增李斯特菌疫苗遞呈研究進展①

丁承超　陳國薇　吳　嫚　劉武康　劉　箐

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093)

·專題綜述·

減毒單增李斯特菌疫苗遞呈研究進展①

丁承超陳國薇吳嫚劉武康劉箐

(上海理工大學醫療器械與食品學院，上海200093)

單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧胞內寄生條件致病菌。該菌可穿越腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障,引起人和動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥[1]。且具有獨有的胞內逃逸存活和胞間傳送等特性，因此是研究胞內寄生的模式細菌。目前研究發現Lm的毒力主要由六個毒力因子編碼基因(prfA-plcA-hly-mpl-actA-plcB)組成。plcA和plcB分別編碼磷脂酰肌醇特異性磷脂酶(PI-PLC)和卵磷脂酶(PC-PLC)，有助于Lm逃離吞噬小體；actA與基于Lm肌動蛋白的運動性有關；hly則與Lm的溶血素有關，參與單增李斯特菌一級和次級吞噬小體的逃離；prfA主要調控Lm的侵襲相關毒力因子，如inlA和inlB等；mpl是一個依賴鋅的金屬蛋白酶基因[2，3]。以“Listeriamonocytogenes+vaccine”為關鍵詞在Medline進行檢索發現，截至(2015/05/06)為止，共有703篇關于Lm作為疫苗載體的研究，其中近五年相關研究為301篇。這些研究表明，Lm能夠同時引起MHCⅠ和MHCⅡ類抗原遞呈系統，具有顯著激發強烈的CD8+和CD4+細胞免疫的能力。同時，減毒Lm作為口服疫苗載體可以調動機體的黏膜免疫效應[4]。近年來隨著對單增李斯特菌毒力基因、跨膜轉運機制研究的不斷深入，以及平衡致死載體和細菌表面展示等技術的快速發展，進一步證明了減毒單增李斯特菌作為高效遞呈抗原活載體的實用價值。迄今為止減毒Lm活載體疫苗已成功應用于人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus HPV)和轉移性胰腺癌等[5-7]人類復雜疾病的免疫治療中。

1減毒Lm的免疫機理及途徑

單增李斯特菌具有典型的胞內寄生和胞間傳遞等特性，減毒后作為疫苗載體，能夠同時引起MHCⅠ和MHCⅡ抗原遞呈系統，刺激機體產生強烈的細胞免疫反應。因此單增李斯特菌已成為最重要的減毒活載體疫苗載體之一。減毒Lm作為疫苗載體有兩條抗原遞呈系統[8,9](如圖1所示)，其一是交叉遞呈途徑(Cross-presentation pathways)，即Lm被宿主吞噬細胞等細胞捕獲并降解后，細菌多肽被樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)通過細胞受體、內吞等作用攝入細胞內，再經MHCⅠ和MHCⅡ兩條途徑分別遞呈給CD8+和CD4+T細胞；另外一條是傳統的遞呈途徑(Classical pathways),即Lm進入細胞后，絕大部分Lm被溶酶體所包裹降解，降解的抗原通過MHCⅡ遞呈給CD4+T細胞，另外有5%～10%的Lm可通過其特有的毒力蛋白LLO降解溶酶體膜后逃逸，逃逸出來的細菌分泌的蛋白被蛋白酶體降解加工后通過MHCⅠ遞呈給CD8+T細胞。Lm從噬菌體的逃逸能力為其獨有，逃逸的Lm在細胞質中表達抗原基因對抗原遞呈至關重要，也是其作為減毒載體的最大優勢。

圖1　Lm抗原遞呈途徑[9]Fig.1　Vaccine delivery of Lm[9]

2減毒Lm作為疫苗載體的優勢

1990年，Wolff等[10]將裸露的脫氧核糖核酸注射給小鼠能引起外源基因的長期表達，由此誕生了脫氧核糖核酸免疫技術，使得DNA疫苗成為繼減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗之后的又一新型疫苗，被譽為第三次疫苗革命。在此后的20多年間，由此引發的DNA疫苗、基因工程疫苗等研究成為疫苗研究的熱點。在實際運用中發現，這種裸露的DNA極易受到環境及宿主的降解，如何能將這些抗原基因在有保護的狀態下遞送給免疫對象成為疫苗開發必須解決的問題。細菌、病毒等微生物本身具有入侵并啟動宿主免疫系統的原始本能，早在一個世紀以前,紐約大夫Coley[11]驚訝地發現將滅活的革蘭氏陽性菌或陰性菌注射進入腫瘤組織后腫瘤出現消退現象。這是第一次將細菌用于腫瘤控制的“原始疫苗載體”。此后有大量研究顯示，微生物疫苗載體在腫瘤控制中有良好的靶向性和控制力,甚至發現某些病原微生物似乎對腫瘤組織有一定的“偏好”[12]。因此，經過毒力基因的減毒，攜帶靶標抗原的減毒活載體疫苗迅速成為新型疫苗研究的熱點。

迄今為止，已開發的減毒疫苗微生物載體包括細菌，如沙門氏菌(Salmonella)、單增李斯特菌、乳酸桿菌(Lactobacilli)等，病毒如腺病毒、皰疹病毒，真菌如釀酒酵母等，與其他疫苗載體或者佐劑相比，微生物載體具有以下優勢:①部分病原微生物偏好入侵抗原提呈細胞比如樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)，抗原遞呈效果好；②可穿透腸道屏障通過血液循環遠程遞呈抗原；③抗原性良好，可刺激機體先天性和獲得性免疫系統；④可攜帶多個抗原研發多價疫苗；⑤能穿透腸道屏障進入血液的疫苗載體，是口服式疫苗研發的最佳選擇[13]。但值得注意的是，雖然微生物減毒疫苗載體一出現，就表現出極大的優勢和良好的應用前景，但其自身毒力基因的潛在安全性、對宿主基因表達的負面影響等也引起人們的關注。而與其他微生物疫苗載體如沙門氏菌相比，Lm存在明顯的優勢：①對環境耐受性強，可在較高的鹽濃度(可高達40%NaCl)以及寬泛的pH(pH3～12)和溫度范圍(0～45℃)內生長，VazquezBoland等[14]研究發現Lm在16～30℃下，均可入侵魚類細胞但30℃入侵最多，這種超強的環境適應能力拓寬了Lm載體疫苗的使用范圍；②抗原遞呈增強能力，Lm表面的脂胞壁酸質、肽聚糖、載脂蛋白等可與DC表面特異性Toll樣受體結合，DC在識別這些抗原后可以通過調節CD80、CD86、MHCⅡ類分子及炎性分子如IL-12、TNF-α起到加強抗原提呈作用[15]；③較好的安全性，減毒后的Lm其毒性下降明顯，如使hly基因發生突變，可使其毒力水平下降105數量級，敲除actA基因可使其毒力下降104數量級[16]。目前，以actA/plcB、actA/inlB、hly、prfA、actA等單個或者多個毒力基因敲除減毒的Lm已成功應用于腫瘤、病毒等DNA疫苗載體中，部分疫苗已經進入Ⅰ期、Ⅱ期臨床實驗；④多種抗原遞呈能力，2006年，Loeffler等[17]發現減毒Lm不僅可以運送抗原蛋白，而且可以運送DNA和RNA，這種多種抗原的遞呈能力為疫苗的免疫保護提供了更多選擇；⑤口服免疫的最佳選擇，2011年Whitney等[18]研究發現，當Lm作為HIV口服式疫苗時不會減弱抗HIV-gag的免疫效應。另外，目前并未發現Lm的胞內寄生和其致病性的必然關系，比如目前關于其致病性報道最多的是其可隨食品傳染人類并導致嚴重的致病甚至死亡，但對其原始宿主，如牛、豬、羊等畜類，并未發現其嚴重的致病性，這為其作為除人類之外的動物減毒疫苗載體提供了可能性。水產品也是Lm的寄主之一，現有研究發現Lm幾乎可以寄生全部水產品，但并未有報道由其引發的水產品疾病爆發[19]。2001年Dietrich等[20]發現用Lm(EGD-e)分別感染鯉魚上皮細胞、刀劍尾魚胚胎細胞和黑色素瘤細胞三種細胞，Lm均可在24 h內高效入侵三種細胞且無差異。因此，早在1996年前后Horne(1997)、Menudier(1996)、Jeyasekaran(1996)等人就提出Lm有望在將來成為漁用疫苗載體[21-23]，但遺憾的是迄今為止并未發現以其為載體的漁用疫苗上市。

3減毒活載體疫苗載體構建及高效抗原遞呈新策略

在活細菌作為疫苗載體的研究中，抗原基因通常克隆至相應質粒的多克隆位點進而整合至細菌染色體內，解決了抗原在遞呈過程中容易降解、免疫原性易丟失等問題[24]。然而在抗原表達系統中質粒需要經過抗生素篩選，無法保證其安全性和免疫效果。首先，抗生素殘留進入生物環境中會導致抗生素污染甚至引發細菌耐藥性問題[25]；而且，在具有抗性的環境下抗原表達量會隨著質粒丟失而下降，最終導致免疫效果低下[26]。因此，選擇合適的抗原遞呈方式是提高細菌載體疫苗免疫效果的有效手段。目前，減毒微生物遞呈疫苗的新策略主要包括平衡致死載體和細菌表面展示技術。

3.1平衡致死載體系統(Balanced lethal vector system)該載體系統針對某些關系細菌生死的關鍵基因，采用“質粒攜帶，菌株缺失”的原則設計，使得菌株的存活依賴于質粒所攜帶的關鍵基因，從而提高質粒遺傳穩定性并擺脫對抗生素的依賴。在針對Lm的研究中發現dal和dat基因分別控制D-丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸轉氨酶的合成，dal、dat基因雙缺失的Lmdd無法合成細胞壁[27]。基于此原理構建的突變Lmdd菌株是目前最成功的減毒Lm疫苗載體。該系統構建原理是在Lm中敲除dal和dat基因，之后在穿梭載體中表達dal基因操縱子并篩選穩定的突變菌株，基于這種“平衡致死系統”構建的突變菌株無需抗生素篩選壓力以確保減毒Lm的存活，有效地解決了最早的減毒活載體疫苗使用中抗生素污染問題，即“綠色減毒疫苗活載體”。 Gaia等[28]在利用減毒Lm作為猴免疾缺陷病毒(Simian immune virus,SIV)疫苗載體的研究中,構建Lmdd平衡致死載體并外源表達SIV-gag(如圖2所示)。結果在口服接種獼猴后同時產生了針對SIV和Lm的細胞免疫反應。另外，其他平衡致死載體系統，如基于asd等基因缺失的載體系統已經成功應用于沙門氏菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、愛德華氏菌等細菌載體疫苗的設計中[29-32]。

3.2細菌表面展示系統(Bacterial surface display system)免疫效果不佳是目前制約細菌載體疫苗臨床應用的最大障礙，其原因在于外源抗原基因在伴隨細菌進入宿主內表達量不足。目前解決此類問題的方法主要集中在如何使抗原基因在進入宿主機體后表達并分泌至細菌表面。表面展示技術使得抗原分泌至細菌表面，易被免疫系統識別。另外，細菌的脂多糖、外膜蛋白等能刺激機體產生非特異免疫。這種類似免疫佐劑功能的疫苗設計理念具有獨特的優勢[33]。目前在疫苗載體研究領域，表面展示技術已經成功應用于沙門氏菌、釀酒酵母和枯草芽孢桿菌等[34-36]微生物。其基本原理(如圖3所示)是將外源蛋白基因序列與特定的錨定蛋白基因序列融合后導入細菌宿主細胞，在信號肽的引導下融合蛋白向細胞外分泌，被展示的外源蛋白可保持相對獨立的空間結構和生物活性[37]。由于革蘭氏陰性菌遺傳背景比較清楚,更便于控制蛋白的展示,因而研究主要集中在革蘭氏陰性菌。而革蘭氏陽性菌跨外膜轉運機制尚不清楚,目前還未有將表面展示技術應用于Lm的研究報道。但從應用角度來看,革蘭氏陽性菌的某些特性更適合于表面展示:首先,革蘭氏陽性菌的蛋白表面展示系統有著相同或類似的表面錨定機制,允許多達幾百個氨基酸的外源蛋白插入。再者,革蘭氏陽性菌所展示的蛋白只需通過單個質膜層,而革蘭氏陰性菌的展示蛋白不僅要通過質膜層還要在外膜上正確的整合,這對展示蛋白的結構和活性可能產生影響。而且,革蘭氏陽性菌細胞壁較厚,因而更堅固而易于操作[38]。在不久的將來，隨著革蘭氏陽性菌外膜蛋白自主轉運機制研究的不斷深入，將表面展示技術應用于Lm以提高抗原遞呈效率的方式可能成為現實。

圖2　Lmdd-SIV-gag平衡致死載體系統的構建[29]Fig.2　Construction of Lmdd-SIV-gag[29]

4展望

疫苗遞送系統與其產生的免疫效力直接相關，如何將免疫原高效地送到MHCⅠ和MHCⅡ類分子并提呈至細胞表面是目前該領域的研究熱點。Lm全基因組2001年測序成功至今才15年，其作為疫苗載體的潛力仍未完全開發。除平衡致死載體和細菌表面展示技術外，很多高效遞呈疫苗的新策略還未應用于Lm疫苗載體的研究中。如Guan等[40]將二元調控機制引入重組大腸桿菌作為疫苗載體的研究中，當大腸桿菌攜帶抗原進入機體后，PviuB調控機制作用從而誘導抗原基因表達。此類調控機制在高效表達抗原方面具有獨特優勢，在Lm作為疫苗載體的研究中值得借鑒。另外，減毒微生物疫苗載體的安全性同樣是細菌載體疫苗研究過程中不可忽視的因素。因此，對Lm毒力基因進行深入探討，尋找最佳的減毒靶標基因，提高其使用安全性同樣是未來研究的主攻方向。相信隨著對Lm毒力基因和跨膜轉運機制認識的深入，不斷會有高效遞呈疫苗的新策略出現并極大促進Lm作為疫苗載體研究的發展。

圖3　細菌表面展示技術錨定系統Fig.3　Bacterial surface display system

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[收稿2015-06-25修回2015-07-13]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.028

作者簡介：丁承超(1992年-)，男，碩士，主要從事病原微生物疫苗研究，E-mail:ding10118026@163.com。 通訊作者及指導教師：劉箐(1970年-)，男，博士，教授，主要從事食源性致病菌致病機理及控制研究研究，E-mail:liuq@usst.edu.cn。

中圖分類號R392.9

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0892-04

①本文受國家自然科學基金(No. 31371776)和上海市科委重點支撐項目(No.13430502400)資助。