TWS119通過抑制STAT3磷酸化促進(jìn)γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)①

徐　晶　孫蕾清　陳永強(qiáng)　鄭　璐　呂小婷　陳復(fù)興　劉軍權(quán)　周忠海

(解放軍第97醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，徐州221004)

·生物治療·

TWS119通過抑制STAT3磷酸化促進(jìn)γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)①

徐晶孫蕾清陳永強(qiáng)鄭璐呂小婷陳復(fù)興劉軍權(quán)周忠海

(解放軍第97醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，徐州221004)

[摘要]目的：研究糖原合酶激酶-3β抑制劑4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5表達(dá)的分子機(jī)制。方法：用TWS119誘導(dǎo)從健康人外周血中分離培養(yǎng)獲得γδT細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)；Western blot檢測(cè)GAPDH和p-STAT3的表達(dá)。結(jié)果：培養(yǎng)10 d后的γδT細(xì)胞純度達(dá)到85.79%±5.01%。TWS119濃度在0～8.0 μmol/L范圍內(nèi)能顯著促進(jìn)趨化因子受體CCR5的表達(dá)，且劑量依賴性抑制STAT3的磷酸化。同時(shí)，用STAT3磷酸化抑制劑Stattic (0.5 μmol/L)預(yù)處理γδT細(xì)胞也可以促進(jìn)CCR5的表達(dá)，并能協(xié)同增強(qiáng)TWS119促進(jìn)趨化因子受體CCR5的表達(dá)。結(jié)論：TWS119通過抑制STAT3磷酸化促進(jìn)γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]TWS119；CCR5；γδT細(xì)胞；STAT3

4,6-二取代吡咯并嘧啶(TWS119)是糖原合酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)抑制劑，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[1,2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)TWS119體外可以誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得記憶性干細(xì)胞樣T細(xì)胞(Memory stem cell-like T cell,TSCM)和早期分化細(xì)胞，這群細(xì)胞體內(nèi)具有較強(qiáng)抗腫瘤活性，跟其在體內(nèi)具有較強(qiáng)的增殖、分化能力及歸巢黏附分子與趨化因子受體的表達(dá)有關(guān)[3,4]。我們研究發(fā)現(xiàn)TWS119體外可促進(jìn)NK細(xì)胞和γδT細(xì)胞與歸巢相關(guān)分子CD62L的表達(dá)[5,6]。CCR5 為趨化因子CC受體家族成員，對(duì)單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有較強(qiáng)的趨化、募集和免疫過程[7,8]。因此，本研究想探討TWS119能否促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5的表達(dá)及其分子機(jī)制，旨在為臨床治療獲得向腫瘤組織高趨向性的γδT細(xì)胞。

1材料與方法

1.1材料TWS119購自Sigma公司；STAT3抑制劑Stattic購自Selleck Chemicals[實(shí)驗(yàn)時(shí)用二甲亞砜(DMSO)溶解，實(shí)驗(yàn)組DMSO終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%，對(duì)照組中加入相同濃度的DMSO]；RPMI1640和小牛血清購自Gibco 公司；Western及IP細(xì)胞裂解液試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液、PVDF膜和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人p-STAT3、GAPDH一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記抗兔二抗購自Bioworld 公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)和唑來磷酸購自諾華制藥公司；熒光抗體FITC-γδTCR和PE-CCR5購自eBioscience；人AB型血漿購自徐州市中心血站。

1.2方法

1.2.1γδT細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定從健康人抽取外周血15 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。用生理鹽水洗滌后，將PBMCs加入γδT細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%小牛血清、5% AB血清、5 μmol/L唑來磷酸和300 U/ml rhIL- 2)中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并定期補(bǔ)加培養(yǎng)基。將培養(yǎng)10 d的γδT細(xì)胞用倒置顯微鏡觀察形態(tài)，用FITC-γδTCR 抗體標(biāo)記γδT細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀鑒定γδT細(xì)胞純度。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)TWS119對(duì)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)的影響將γδT細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板，3.0×105/3 ml/孔，然后加入TWS119(終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L)或Stattic (0.5 μmol/L)。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌1次，分別向每管細(xì)胞中加入10 μl的anti-γδTCR-FITC和anti-CCR5-PE，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot分析蛋白的表達(dá)將經(jīng)不同濃度TWS119或Stattic (0.5 μmol/L)處理48 h的γδT細(xì)胞，收集后用Western及IP細(xì)胞裂解液50 μl充分裂解提取蛋白，BCA法測(cè)樣品蛋白濃度后用8% SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)4℃封閉過夜，二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。然后用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒，按照操作手冊(cè)進(jìn)行顯色。結(jié)果用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照記錄，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1γδT細(xì)胞鑒定將分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，用γδT細(xì)胞完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d后γδT細(xì)胞開始增殖，到第10天后出現(xiàn)許多大小不同的細(xì)胞集落，細(xì)胞成梭形(圖1A、B)。用流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果：γδT細(xì)胞比率為(85.79±5.01)% 如圖1C。以上結(jié)果提示γδT 細(xì)胞培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2TWS119促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5的表達(dá)CCR5是表達(dá)于γδT淋巴細(xì)胞表面的主要趨化因子受體蛋白之一，介導(dǎo) CCR5+γδT細(xì)胞的趨化、募集和免疫過程。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如圖2顯示，TWS119作用γδT細(xì)胞48 h后，能顯著促進(jìn)γδT細(xì)胞表面CCR5受體的表達(dá)，且具有劑量依賴性(P<0.05,P<0.01)。

2.3TWS119對(duì)γδT細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)的影響將不同濃度TWS119培養(yǎng)的γδT細(xì)胞經(jīng)Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著 TWS119 濃度增加，γδT細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)量逐漸減少，即TWS119能抑制STAT3磷酸化，且具有一定的劑量依賴性(圖3)。

圖1　γδT細(xì)胞鑒定Fig.1　Identification of γδT cells

圖2　TWS119對(duì)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)的影響Fig.2　Effect of TWS119 on expression of CCR5 in γδT cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

圖3　TWS119對(duì)γδT細(xì)胞中p-STAT3蛋白表達(dá)的影響Fig.3　Western blot analysis of p-STAT3 expression in γδT cells

圖4　STAT3抑制劑Stattic對(duì)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)的影響Fig.4　Effect of Stattic on expression of CCR5 in γδT cells

2.4STAT3抑制劑Stattic對(duì)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)的影響為了驗(yàn)證TWS119通過抑制STAT3磷酸化來促進(jìn)γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)，我們用TWS119和STAT3特異性抑制劑Stattic分別和聯(lián)合作用γδT細(xì)胞48 h后，蛋白水平檢測(cè)結(jié)果顯示， 2.0 μmol/L的TWS119和0.5 μmol/L的Stattic能明顯抑制p-STAT3的表達(dá)，而且兩者聯(lián)合作用時(shí)具有一定的疊加或協(xié)同抑制作用(圖4A)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)結(jié)果顯示，STAT3特異性抑制劑Stattic能顯著提高γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)，對(duì)照組CCR5陽性表達(dá)率為(35.89±2.52)%，TWS119(2.0 μmol/L) 組為(61.14±2.98)%， Stattic(0.5 μmol/L) 組為(47.27±1.84)%；Stattic與TWS119聯(lián)合組CCR5陽性表達(dá)率為(75.31±3.08)%，提示TWS119通過抑制STAT3磷酸化來促進(jìn)γδT細(xì)胞CCR5表達(dá)，可能其他信號(hào)通路也有一定的參與(圖4B)。

3討論

趨化因子屬于細(xì)胞因子超家族的一類小分子物質(zhì)，主要由白細(xì)胞分泌，通過與靶細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。CCR5 為趨化因子 CC 受體家族成員，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，CCR5 可以在多種細(xì)胞上表達(dá)，如NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，與其配體 CCL3 ( MIP-1α) 、CCL4 ( MIP-1β) 和CCL5( RANTES)結(jié)合后，可激活膜內(nèi)G 蛋白，并引起胞內(nèi)Ca2+濃度上升及蛋白激酶C的活化，從而表現(xiàn)出白細(xì)胞的趨化性及炎癥反應(yīng)等各種生理功能[7,8]。γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中表達(dá)γδTCR的一個(gè)亞群，研究人員發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的 γδT 細(xì)胞表面趨化因子受體 CCR5表達(dá)顯著高于αβT 細(xì)胞，這可能與其在機(jī)體內(nèi)抗感染、抗腫瘤和免疫監(jiān)視等方面起重要作用有關(guān)[9,10]。本研究中發(fā)現(xiàn)TWS119能顯著促進(jìn)γδT細(xì)胞趨化因子受體CCR5的表達(dá)，且具有劑量依賴性，提示用TWS119誘導(dǎo)培養(yǎng)的γδT細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)后可能具有更好的腫瘤組織趨向性。另外，γδT細(xì)胞還具有抗原提呈功能，荷載腫瘤抗原的γδT細(xì)胞高表達(dá)CCR5可能會(huì)增強(qiáng)其誘發(fā)機(jī)體適應(yīng)性抗腫瘤免疫能力，為γδT細(xì)胞腫瘤疫苗的臨床應(yīng)用提供支持[11]。

STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)家族的重要成員，存在于細(xì)胞漿與酪氨酸磷酸化信號(hào)通道偶聯(lián)的雙功能蛋白，在胞外信號(hào)的刺激下可激活STAT3即STAT3磷酸化，之后發(fā)生二聚化進(jìn)入胞核，識(shí)別并結(jié)合于特定的DNA啟動(dòng)子序列，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程[12,13]。我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TWS119能抑制γδT細(xì)胞中STAT3蛋白的磷酸化。為了研究STAT3信號(hào)通路與CCR5表達(dá)之間的關(guān)系。我們分別用2.0 μmol/L 的TWS119和0.5 μmol/L的 STAT3抑制劑Stattic單獨(dú)和聯(lián)合處理γδT細(xì)胞48h后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們均能抑制STAT3蛋白的磷酸化的同時(shí)并能促進(jìn)CCR5表達(dá)，兩者聯(lián)合時(shí)結(jié)果具有一定的疊加或協(xié)同作用，提示STAT3信號(hào)通路參與γδT細(xì)胞CCR5的表達(dá)。

本研究結(jié)論是用TWS119體外培養(yǎng)γδT細(xì)胞時(shí)通過抑制STAT3的磷酸化信號(hào)通路來促進(jìn)趨化因

子受體CCR5的表達(dá)。為體外擴(kuò)增在體內(nèi)具有腫瘤組織趨向性的CCR5+γδT細(xì)胞提供準(zhǔn)確的作用靶點(diǎn)和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2016-01-13修回2016-03-23]

(編輯張曉舟)

TWS119 upregulates CCR5 expression of γδT cells by inhibiting STAT3 phosphorylation

XU Jing,SUN Lei-Qing,CHEN Yong-Qiang,ZHENG Lu,LV Xiao-Ting,CHEN Fu-Xing,LIU Jun-Quan,ZHOU Zhong-Hai.

Department of Central Laboratory,97th Hospital of PLA,Xuzhou 221004,China

[Abstract]Objective:To investigate the mechanisms of TWS119 induced CCR5 expression in hunman γδT cells.Methods: After treatment with various concentrations of TWS119 for 48h,the expression of CCR5 in γδT cells were detected by flow cytometry.The p-STAT3 and GAPDH expression were examined by Western blot analysis.Results: TWS119 could upregulate the expression of CCR5 in dose dependent manner.Western blot analysis revealed that TWS119 inhibit phosphorylation of STAT3,but had no significant impact on GAPDH.In addition,pretreatment of γδT cells with 0.5 μmol/L STAT3 specific phosphorylation inhibitor Stattic could upregulate the expression of CCR5 and enhance the TWS119 induced CCR5 expression.Conclusion: TWS119 could upregulate CCR5 expression of γδT cells by inhibiting STAT3 phosphorylation in vitro.

[Key words]TWS119;CCR5;γδT cells;STAT3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.012

作者簡(jiǎn)介：徐晶(1990年-)，女，技師，主要從事分子免疫學(xué)方面的研究，E-mail:920213370@qq.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：鄭璐(1985年-)，女，主管技師，主要從事分子免疫學(xué)方面研究，E-mail:xsdzhenglu@163.com。 周忠海(1973年-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:zhouzhonghai298@aliyun.com。

中圖分類號(hào)R392.12Q253

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0825-04

①本文受南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新研究基金(14MS032) 資助。