節(jié)律基因Clock對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖的影響*

楊振華　李小雪　王正榮　楊淑紅　江舟　成姝婷　劉延友　汪宇輝　肖靜

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610041)

·論著·

節(jié)律基因Clock對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖的影響*

楊振華李小雪王正榮楊淑紅江舟成姝婷劉延友汪宇輝肖靜

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院·衛(wèi)生部時間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探討節(jié)律基因Clock對膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法通過小片段干擾 RNA(small interfering，siRNA)特異性沉默C6細(xì)胞Clock基因的表達(dá)。 采用 CCK-8試劑盒檢測C6細(xì)胞的增殖情況，并利用流式細(xì)胞儀檢測Clock基因沉默后C6細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，通過熒光定量Q-PCR檢測β-catenin和Tcf1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果與空白對照組和陰性對照組相比，SiClock轉(zhuǎn)染組C6細(xì)胞增殖活力明顯降低，S期細(xì)胞所占比例明顯下降，同時β-catenin和Tcf1 mRNA的表達(dá)也明顯降低(均P<0.05)。結(jié)論干擾節(jié)律基因Clock表達(dá)，能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。其機(jī)制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)其作用。

【關(guān)鍵詞】節(jié)律基因；Clock；C6；增殖

近日節(jié)律是一種基本的生命活動現(xiàn)象。從單細(xì)胞生物到哺乳動物都存在這一活動現(xiàn)象[1]。近日節(jié)律基因不僅在節(jié)律的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，而且還參與其他機(jī)體生理和病理過程[2]。早期對夜班工人的研究表明，節(jié)律紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。如肺癌[3]、膠質(zhì)瘤[4]、皮膚癌[5]、前列腺癌[6]和胃癌[7]等。有很多基因調(diào)控人類的晝夜節(jié)律，如：Clock、Bmal1、Period1(PER1)、Period2(PER2)、Period3(PER3)、Cryptochrome1 (CRY1)、Cryptochrome2 (CRY2)、Caseinkinase1e(CK1e)和Timeles(TIM)等[8]。Clock基因是節(jié)律調(diào)控通路中最核心的調(diào)控元件[9]，在腫瘤的生長中發(fā)揮重要作用。Miller等人研究表明，Clock突變后能明顯抑制細(xì)胞生長和增殖[10]。最近有研究表明，E2-Erα通路誘導(dǎo)Clock基因表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[11]。

Wnt/β-catenin信號通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路，它調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輔助因子β-catenin的穩(wěn)定性并依賴β-catenin基因的表達(dá)[12]。該通路由Wnt家族分泌蛋白(Wnt)、特異性受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)riz)、原癌基因β連環(huán)蛋白(β-catenin，β-cat)、TCF(T cell factor)/LEF(lymphoid enhancer factor)家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和其他組分組成。β-catenin和TCF/LEF是Wnt/β-catenin信號通路重要的調(diào)節(jié)因子。有文獻(xiàn)表明，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的生長發(fā)育密切相關(guān)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)擬通過小片段干擾 RNA(small interfering，siRNA)特異性沉默膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞Clock基因的表達(dá)，以此探討Clock基因的沉默效應(yīng)對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，并對其機(jī)制作進(jìn)一步研究，為腫瘤的基因治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 C6細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEMI培養(yǎng)液、胎牛血清(美國，HyClone)，LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、Trizol 試劑(美國，Inxitrogen)，青霉素、鏈霉素混合液、0.25% 胰酶混合液(美國，Hyclone)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國，Corning)，DMSO、DEPC(美國，Sigma)，2×All in oneTM Q-PCR Mix(美國，Invitrogen)，HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(北京，康為世紀(jì))，SiClock(廣州，銳博生物)，其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器倒置生物顯微鏡TE 2000-U(日本，Nikon)，CO2恒溫細(xì)胞孵箱(日本，SANYO)，熒光PCR儀(美國，Bio-Rad)，低溫離心機(jī)(德國，Eppendorf)，微量移液器(德國，Eppendorf)，流式細(xì)胞儀(美國，BD)，超凈細(xì)胞工作臺、超純水儀、電子天平等均為國產(chǎn)。

1.1.4引物序列引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)C6細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，5%CO2濃度，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染在6孔板培養(yǎng)的 C6細(xì)胞密度長到60%左右時用LipofectamineTM 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑把SiClock轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置在37℃的 CO2孵箱中孵育24小時后，提取RNA。細(xì)胞分組為SiClock組(SC)、陰性對照組(NC)和空白對照組(CT)，每組都設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.3CCK-8測試在96孔板培養(yǎng)的 C6細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24～72h后(從24小時開始檢測，間隔12小 時)，加入CCK-8試劑，10μl/孔，設(shè)6復(fù)孔，37℃的 CO2孵箱中孵育4小時，用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度。

1.2.4RNA提取與cDNA的合成用胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，加Trizol試劑冰上裂解細(xì)胞，提取RNA。用Nanodrop檢測RNA的濃度和純度。分別取2μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.5熒光定量PCR使用2×All in oneTM Q-PCR Mix擴(kuò)增目的基因。Q-PCR程序：95℃，10min；95℃，10s，60℃，20s，72℃，20s，39個循環(huán)；95℃，10s；65～95℃,5s。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期將轉(zhuǎn)染后36小時的各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，2000rpm、5分鐘離心收集細(xì)胞。PBS洗滌后，75 % 乙醇-20 ℃固定過夜。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

2結(jié)果

2.1Clock基因mRNA的表達(dá)利用RNAi干擾C6細(xì)胞Clock基因的表達(dá)。提取SiClock轉(zhuǎn)染組(SC)、陰性對照組(NC)和空白對照組(CT)C6細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用熒光定量PCR檢測各組C6細(xì)胞Clock的表達(dá)量。結(jié)果顯示，SC組Clock基因mRNA的相對表值為0.62±0.18，NC組、CT組Clock基因mRNA的相對表達(dá)值為1.60±0.28和1.87±0.34，見圖1。與NC組和CT組相比，SC組C6細(xì)胞Clock基因mRNA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1C6細(xì)胞Clock基因mRNA的表達(dá)水平

Figure 1The mRNA expression level of Clock gene in C6 cells

2.2CCK-8測試結(jié)果使用CCK-8試劑盒檢測Clock基因沉默后C6細(xì)胞的增殖活力，結(jié)果見表2、圖2。與NC組和CT組相比，SC組C6細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2　C6細(xì)胞活性測定

注：與CT組和NC組相比，①P<0.05

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化結(jié)果使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，處于S期C6細(xì)胞在總體中占的比例，SC組為(21.36±1.44)%，NC組為(26.25±1.36)%，CT組為(27.67±1.03)%，見圖3。與NC組和CT組相比，SC組S期細(xì)胞所占比例明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖2CCK-8法測定C6細(xì)胞活性

Figure 2Cell viability of C6 cell at different time

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測C6細(xì)胞周期

Figure 3Flow cytometric analysis of cell cycle in C6 cells

注：a. CT組，b. NC組，c. SC組

2.4β-catenin基因mRNA的表達(dá)利用RNAi干擾C6細(xì)胞Clock基因的表達(dá)。探討Clock基因沉默后對β-catenin基因表達(dá)的影響。利用熒光定量PCR檢測各組C6細(xì)胞β-catenin的表達(dá)量。結(jié)果顯示，SC組β-catenin基因mRNA的相對表達(dá)值為0.68±0.18，NC組、CT組β-catenin基因mRNA的相對表達(dá)值為0.98±0.22和1.10±0.16，見圖4。與NC組和CT組相比，SC組C6細(xì)胞β-catenin基因mRNA的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5Tcf1基因mRNA的表達(dá)利用RNAi干擾C6細(xì)胞Clock基因的表達(dá)。探討Clock基因沉默后對Tcf1基因表達(dá)的影響。利用熒光定量PCR檢測各組C6細(xì)胞Tcf1的表達(dá)量。結(jié)果顯示，SC組Tcf1基因mRNA的相對表達(dá)值為0.44±0.03，NC組CT組Tcf1基因mRNA的相對表達(dá)值為0.95±0.15和1.02±0.09，見圖5。與NC組和CT組相比，SC組C6細(xì)胞Tcf1基因mRNA的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。

圖4C6細(xì)胞β-catenin mRNA的表達(dá)

Figure 4The mRNA expression level ofβ-cateningene in C6 cells

圖5C6細(xì)胞Tcf1 mRNA的表達(dá)

Figure 5The mRNA expression level ofTcf1 gene in C6 cells

3討論

近日節(jié)律調(diào)控機(jī)體各個系統(tǒng)的功能，對機(jī)體各個系統(tǒng)之間、機(jī)體與環(huán)境之間的和諧穩(wěn)定起著重要作用，其產(chǎn)生機(jī)制是一系列近日鐘基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所產(chǎn)生的分子振蕩。當(dāng)外界因素?cái)_亂了機(jī)體正常的近日節(jié)律，可能引發(fā)機(jī)體一系列的疾病，甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。大量的研究表明，近日節(jié)律紊亂和癌癥發(fā)生密切相關(guān)[16]。近日鐘基因可以調(diào)控原癌基因和抑癌基因以及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，直接或者間接的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展方面起著重要的作用[17]。Clock基因是近日節(jié)律的核心基因，參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理生化活動，包括癌細(xì)胞的增殖過程[11]。大量研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的生長與近日節(jié)律密切相關(guān)[4, 18,19]。陳曉魏等[20]人研究表明，Clock基因在高級別腦膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用siRNAClock基因后，利用CCK-8檢測細(xì)胞的活性，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)沉默Clock基因會顯著性地抑制C6細(xì)胞的活性，降低了S期細(xì)胞所占比例，說明Clock基因參與C6細(xì)胞的增殖過程。

Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生理活動，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和分裂，在生物進(jìn)化中極為保守[21]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的生長發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用[22,23]。β-catenin和TCF/LEF是Wnt/β-catenin信號通路最重要的調(diào)節(jié)因子。β-catenin由Ctnnb1基因產(chǎn)生，是Armadillo蛋白家族成員的一個亞型，主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞間黏附。 β-catenin在核內(nèi)的聚集及功能的激活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。GSK-3β以及CK1A可以使 -catenin 的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致β-catenin降解復(fù)合物被泛素連接酶識別并泛素化，最終被蛋白酶體降解，從而使細(xì)胞內(nèi)β-catenin含量保持在較低水平，維持細(xì)胞的正常生長。當(dāng)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中濃度不斷增加時，就會轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF結(jié)合，啟動下游基因如原癌基因cyclinD1的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，Clock基因沉默會顯著降低C6細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞增殖。RT-qPCR檢測β-catenin和Tcf1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Clock基因沉默組表達(dá)水平顯著降低，提示Clock基因可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路中β-catenin和Tcf1的表達(dá)來調(diào)節(jié)C6細(xì)胞增殖。Clock基因參與調(diào)控C6細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，干擾Clock基因表達(dá)，會使β-catenin和Tcf1的表達(dá)水平降低，并且會抑制C6細(xì)胞的增殖，推測Clock基因可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖過程。揭示近日節(jié)律系統(tǒng)參與調(diào)控癌細(xì)胞增殖過程，為腫瘤的預(yù)防和治療提供了一個新的研究思路和理論基礎(chǔ)。

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Proliferation effect of circadian gene Clock on glioma cells

YANG Zhenhua, LI Xiaoxue, WANG Zhengrong, et al

(KeyLaboratoryofChronobiology,MinistryofHealth(SichuanUniversity),WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of circadian gene Clock on glioma C6 cells and its mechanism. Methods The expression level of Clock gene in C6 cells were specifically knocked down by RNA interference. The effect of C6 cells on cell growth and proliferation was demonstrated with CCK-8 assay. The cell distribution in cell cycle was detected by flow cytometry. The expression of β-catenin and Tcf1 were detected by Q-PCR. ResultsCompared with the blank control group and the negative control group, the cells transfected with SiClock had the lower rate of cellular proliferative capacity. Meanwhile, the proportion of S phase cells decreased obviously. The mRNA expression of β-catenin and Tcf1 were significantly reduced. ConclusionClock gene knocked down inhibited the proliferation of glioma cell,which mechanism might involve the Wnt/β-catenin signaling pathway.

【Key words】Circadian genes; Clock; C6; proliferation

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31371180)，國家自然科學(xué)青年基金(31500935)

通訊作者：王正榮，教授，本刊常務(wù)編委，主要從事時間生物學(xué)研究，Email：wangzhengrong@126.com

【中圖分類號】R-33;R 739.41

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.003

(收稿日期：2016-01-19； 編輯： 母存培)