Ki-67在犬乳腺腫瘤的表達與分析

衛順生1，2，王華南2，3，胡　楊2，杜宏超2，李越華4，裴世敏2，楊　旭2，張　紅2，周　斌2，張　迪2，金藝鵬2，林德貴2（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032；2.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；3.浙江大學動物科學學院，浙江杭州310012；4.太原博愛寵物醫院，山西太原030024）

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Ki-67在犬乳腺腫瘤的表達與分析

衛順生1，2，王華南2，3，胡楊2，杜宏超2，李越華4，裴世敏2，楊旭2，張
紅2，周斌2，張迪2，金藝鵬2，林德貴2
（1.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032；2.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；3.浙江大學動物科學學院，浙江杭州310012；4.太原博愛寵物醫院，山西太原030024）

摘要：本試驗通過免疫組化的方法，檢測了從中國農業大學教學動物醫院收集到的6個正常乳腺組織和135例乳腺腫瘤組織（良性30例，惡性105例）Ki-67的表達率。結果犬乳腺腫瘤組織中的Ki-67蛋白表達率明顯高于正常乳腺組織（P<0.05）；犬惡性腫瘤組織中的Ki-67蛋白表達率明顯高于良性腫瘤（P<0.05）。表明Ki-67在惡性腫瘤里高表達，可以作為犬乳腺腫瘤疾病診斷的指標。

關鍵詞：犬乳腺腫瘤；Ki-67蛋白；免疫組化；惡性腫瘤；良性腫瘤

1　材料與方法

1.1動物材料采集自2012年5月至2013年6月間，中國農業大學教學動物醫院臨床確診的乳腺腫瘤患犬的腫瘤病料135例，其中良性腫瘤（30例），包括良性混合瘤（10例）、混合腺瘤（8例）、導管乳頭狀瘤（12例）;惡性腫瘤（105例），包括實體癌（60例）、導管乳頭狀癌（25例）、纖維肉瘤（5例），原位癌（5例）和混合癌（10例）；以及健康試驗犬正常組織（6例）。患犬年齡在3～20歲之間，平均年齡8.98±3.73歲。無菌手術器械對腫瘤不同部位進行取材，無菌生理鹽水沖洗后，用10倍體積的4%中性甲醛固定液固定。

1.2主要試劑及儀器Ki-67單克隆抗體、DAB顯色試劑盒、PV9000通用型，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；切片機、攤片機、烤片機、組織包埋、光學顯微鏡、載玻片。

1.3試驗方法對所有收集到的乳腺腫瘤組織進行Ki-67免疫組織化學染色。免疫組織化學染色方法參照文獻[8]。簡要步驟如下：將上述固定的乳腺組織用組織包埋機進行石蠟包埋；每個石蠟組織至少制備2張0.3 μm的切片；第一張切片制備H.E.染色，進行病理學分類;另一張組織切片經過脫蠟、水化、修復抗原、封閉、加一抗、加二抗、顯色等過程完成Ki-67的免疫組織化學染色。

1.4結果判定標準及分析方法對Ki-67蛋白的免疫組化染色以細胞核出現棕黃色顆粒而細胞質無染色者為Ki-67蛋白表達陽性，結果判定以陽性細胞所占百分比表示，即高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞，以陽性細胞占細胞總數百分數進行陽性細胞表達量進行統計。采用社會科學統計軟件包（Statistical Package for social sciences，SPSS）19.0版統計軟件對所得數據進行統計學處理，統計學軟件選用fisher's精確檢驗法、Pearson相關分析進行檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有高度統計學意義。

2　結果

2.1Ki-67蛋白在正常乳腺組織中的表達從中插彩版圖1可看出，Ki-67主要表達于細胞核，大部分正常乳腺組織幾乎不表達（中插彩版圖1-A），只有一少部分正常乳腺組織少量表達Ki-67（中插彩版圖1-B）。

2.2Ki-67蛋白在乳腺腫瘤的表達從中插彩版圖2可看出，Ki-67在良性腫瘤中的表達量很低，幾乎不表達，而在犬乳腺癌中高表達，主要高表達于腺上皮細胞核。少量表達于肌上皮，纖維細胞較少表達。

2.3Ki-67蛋白表達在乳腺組織的表達量及與腫瘤良惡性的關系按照免疫組化結果的判定標準，如表1所示，我們列出Ki-67在犬乳腺的不同組織類型及乳腺腫瘤的不同組織學分型之間的表達量分布情況。結果顯示，不同組織學分型的腫瘤之間具有顯著性差異，P<0.01；對照組（n=6）Ki-67陽性表達的細胞數值范圍為1.04%±1.85% （0～5%）；腫瘤組（n=135）Ki-67陽性表達細胞數值范圍為24.26%±26.88%（0～90%）；其中良性腫瘤（n=30）Ki-67陽性表達細胞數值為6.83%± 4.49%（0～10%）；惡性腫瘤（n=105）Ki-67陽性表達細胞數值為29.24%±28.50%（0～90%）。以Ki-67蛋白表達量50%為臨界值，采用Fisher′s檢驗Ki-67表達與犬乳腺腫瘤良性與惡性的關系，如表2所示，Ki-67蛋白表達在正常乳腺與腫瘤之間不存在顯著性差異，P>0.05（P=0.3471）；在良性與惡性腫瘤之間表達量也存在顯著差異P<0.05 （P=0.00096）。

表1　Ki-67在犬乳腺腫瘤中的表達情況

3　討論

本試驗共收集到乳腺腫瘤組織135例，其中惡性腫瘤105例，所占比例為77.8%，其值高于國外的50%，因為國內一般等腫瘤變得很大才進行手術治療，這時腫瘤往往已經發生轉移和惡化。有很多病理學家把包膜具有完整性的腫瘤直接被劃分為良性腫瘤，但這并不科學，因為腫瘤惡性程度主要取決于核分裂相、細胞的異型性、核質比等諸多因素，主要根據病理結果進行定論。本試驗中如果局部出現惡性程度高的區域，即使其他部分較良性且包膜完整，我們也將之化分為惡性腫瘤，有利于控制腫瘤的發展；另外，對于長有多個腫瘤的病例，我們只統計惡性程度最高的那一個腫瘤作為整只犬的病理結果，利于及早進行癌癥治療。

Ki-67蛋白存在于增殖細胞核，是一種非組蛋白核蛋白，由345 kD、395 kD的兩條多肽鏈組成[9]。Ki-67抗原在Gl中期到晚期出現，S期和G2期逐漸增加，M期達到最高值，M期后迅速，其半衰期短。Ki-67作為一種與細胞周期相關的增殖細胞核蛋白，只與增生細胞核反應，無組織特異性，是一個界定細胞凋亡和增殖的有價值的標記物。Ki-67能準確地反映腫瘤細胞的增殖活性，其與多種腫瘤的發展、轉移及預后有關。在人類腫瘤研究領域，Ki-67的表達變化能較好的反映腫瘤增殖活性、對判斷腫瘤的惡性程度、預后和指導腫瘤的術后輔助治療有著極其重要的意義[10]。

本試驗顯示，犬乳腺腫瘤組織中的Ki-67蛋白陽性率明顯高于正常乳腺組織，表明腫瘤細胞的核增殖性比正常乳腺細胞活躍，對腫瘤的診斷具有重要的意義；此外，我們還發現，犬惡性腫瘤組織中的Ki-67蛋白陽性率明顯高于良性腫瘤，對腫瘤的預后分析具有重要的診斷意義。本試驗結果與人類醫學相關研究結果一致。我們的研究結果提示Ki-67是犬乳腺腫瘤的一個良好的生物標記物，可作為犬乳腺腫瘤的預后指標。

表2　Ki-67蛋白的表達與犬乳腺腫瘤臨床病理學特征的關系

參考文獻：

[1] Shafiee R，Javanbakht J，Atyabi，N，et al.Diagnosis，classifica?tion and grading of canine mammary tumours as a model to study human breast cancer：an Clinico-Cytohistopathological study withenvironmental factors influencing public health and medicine[J] . Cancer Cell Int，2013.13：79.

[2] Brown D C，Gatter K C . Monoclonal antibody Ki-67：its use in histopathology[J].Histopathology，1990，17（6）：489-503.

[3]何振宇，李彪，胡英，等.Ki67在乳腺癌組織中的表達及臨床病理分析[J].中國初級衛生保健，2005，12：94-95.

[4] Ng I O，Na J，Lai E C，et al.Ki-67 antigen expression in hepato?cellular carcinoma using monoclonal antibody MIB1 . A compari?son with proliferating cell nuclear antigen[J] . Am J Clin Pathol，1995，104：313-318.

[5] Garzetti G G，Ciavattini A，Goteri G，et al . Ki67 antigen immu?nostaining（MIB 1 monoclonal antibody）in serous ovarian tumors：index of proliferative activity with prognostic significance[J].Gyne?col Oncol，1995.56：169-174.

[6]王曉琴，戴穹，楊志惠.bcl-2、Ki-67和bax蛋白在宮頸上皮內瘤變和宮頸癌中的表達及臨床意義[J].中國醫療前沿，2008，2：27-28.

[7]宋作慶，徐蕭洪，韋森，等.肝素酶及Ki-67在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J].中國肺癌雜志，2009，7：785-788.

[8] Huanan W，Xu Y，Yipeng J，et al.Expression and significance of CHIP in canine mammary gland tumors[J].J Vet Med Sci，2015，77：1465-1471.

[9] MacCallum D E，Hall P A . The location of pKi67 in the outer dense fibrillary compartment of the nucleolus points to a role in ribosome biogenesis during the cell division cycle[J] . J Pathol，2000，190：537-544.

[10] Yerushalmi R，Woods R，Ravdin P M，et al.Ki67 in breast can?cer：prognostic and predictive potential[J] . Lancet Oncol，2010. 11：174-183.

中圖分類號：S858.292

文獻標志碼：B

文章編號：0529-6005（2016）05-0038-02

收稿日期：2015-12-31

基金項目：國家自然科學基金（31572578；31372489）

作者簡介：衛順生（1964-），男，助理研究員，博士，從事寵物診療動物外科手術及中獸醫和針灸工作，E-mail：tyboaipet@126. com

通訊作者：林德貴，E-mail：csama@sina.com乳腺腫瘤是犬最常見的腫瘤之一，大約50%的犬乳腺腫瘤屬于惡性腫瘤，并且手術切除之后，往往復發率較高[1]。目前，腫瘤標記物可以用于腫瘤的檢測、診斷、評估癌癥風險、監測疾病的復發和預測疾病的預后，因此找到良好的腫瘤標記物意義重大。研究表明，Ki-67存在于細胞核內[2]，在細胞增殖過程中起著至關重要的作用，可以用來識別生長中的正常細胞和腫瘤細胞，評估細胞的增生程度。在人類腫瘤研究中，很多研究都已經證實Ki-67與乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌等癌癥關系密切[3-7]。而Ki-67在犬乳腺腫瘤的表達情況報道較少，因此，我們研究了Ki-67在中國農業大學所收集的北京市135例犬乳腺腫瘤的表達情況，將對犬乳腺腫瘤的早期診斷、預后判斷及治療方面具有重要的指導意義。