高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（J XA1-R株）微載體懸浮培養工藝研究

徐宏軍，韓　燾，岳豐雄，周　智，舒經香，翟新驗，胡來根，楊漢春（.中國農業大學動物醫學院，北京海淀009；.成都天邦生物制品有限公司，四川成都6000；.中國動物疫病預防控制中心，北京朝陽005）

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高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（J XA1-R株）微載體懸浮培養工藝研究

徐宏軍1，2，韓燾3，岳豐雄2，周智3，舒經香2，翟新驗3，胡來根2，楊漢春1
（1.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；2.成都天邦生物制品有限公司，四川成都610100；3.中國動物疫病預防控制中心，北京朝陽100125）

摘要：為了建立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）的Marc-145微載體細胞懸浮培養工藝以提高HPPRRSV抗原效價，以BC-7L生物反應器微載體懸浮培養Marc-145細胞，對HP-PRRSV接毒時間、接毒劑量、維持液血清濃度、溶氧量參數、病毒增殖溫度等工藝參數進行了摸索和優化。通過細胞懸浮培養逐級放大工藝，在BC-100L生物反應器中培養Marc-145細胞，以優化后HP-PRRSV懸浮培養工藝進行3個批次的病毒懸浮培養。結果在Marc-145細胞微載體懸浮培養的第4天按照感染復數（multiplicity of infection，MOI）為0.1的劑量接毒，接毒后以2%新生牛血清的維持液進行維持培養，溶氧參數設置為40%，最佳培養溫度為37℃，最佳收獲病毒時間為70～74 h。BC-100L生物反應器中培養的3批病毒增殖曲線與BC-7L培養的病毒增殖曲線相近，在接毒后72 h左右達到病毒效價高峰，病毒含量均不低于108.0TCID50/mL。表明HP-PRRSV懸浮培養工藝穩定，可以實現逐級放大、規模化生產。

關鍵詞：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；微載體；生物反應器；懸浮培養

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的接觸性傳染病，主要引起母豬懷孕后期流產、早產、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙。20世紀80年代美國首先報道PRRSV，后迅速傳播至世界各個養豬發達國家。我國于1996年首次分離到該病毒。2006年，我國多個省份的養豬場出現高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情，其中商品豬的死亡率超過50%，母豬死亡率也高達5%以上，給我國養豬業造成巨大損失。目前HP-PRRSV毒株已經成為我國的主要流行（優勢）株，并在我國周邊國家也出現該病的流行。

目前該病的主要防控措施為疫苗免疫，然而我國豬繁殖與呼吸綜合征疫苗種類多，產品質量參差不齊。本研究旨在通過微載體懸浮培養技術提高HP-PRRSV半成品培養效價，進而提高該病疫苗質量。誕生于20世紀60年代的細胞懸浮培養技術可以進行大規模細胞培養，能夠獲得大量的病毒產物和高質量的疫苗產品，在國外疫苗生產中普遍應用[1]。細胞微載體懸浮培養不僅可以提高單位體積內的細胞量、提高病毒產品效價，同時還具有勞動成本低、產品批間差異小等優點。動物細胞微載體懸浮培養技術已經過近50年的發展，目前已成功應用于流感等多種疫苗的生產過程中[2-3]。在國外，細胞微載體培養技術水平已經達到6t反應器自動控制的生產規模，生產效能呈幾何級數放大，而我國微載體培養技術還處于起步階段，未來必將成為我國動物疫苗生產的主流技術之一。

1　材料與方法

1.1細胞與毒種Marc-145細胞和HP-PRRSV （JXA1-R株）由中國動物疫病預防控制中心提供。HP-PRRSV（JXA1-R株）基礎種子批（編號JXA1-R-JC-0002），由成都天邦生物制品有限公司提供。

1.2主要試劑DMEM培養基、新生牛血清，均購自GIBCO公司；硅化劑PlusOne Repel-Silane ES，購自GE公司；NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等為國產分析純試劑；CytodexⅠ型微載體，購自GE公司。

1.3主要器材BC-7L、BSISL-42L、BC-100L生物反應器。

1.4Marc-145細胞懸浮培養常規方法復蘇Marc-145細胞，按照已確定的Marc-145細胞懸浮培養工藝在BC-7L生物反應器中進行Marc-145細胞懸浮培養。培養參數見表1。

1.5HP-PRRSV微載體懸浮培養最佳工藝參數優化按Marc-145細胞微載體懸浮培養工藝進行細胞培養，分別對（1）細胞接毒時間：在細胞生長3、4、5日（方案1、2、3）接毒；（2）接毒劑量：按MOI= 0.01、MOI=0.05、MOI=0.1和MOI=0.2（方案1、2、3、4）接毒；（3）維持液血清濃度：以含1%、2%、4%血清的DMEM培養液（方案1、2、3）作為接毒后細胞維持液；（4）溶氧量：以30%、40%、50%的溶氧參數（方案1、2、3）進行病毒增殖；（5）增殖溫度：以35℃、36℃、37℃的培養溫度（方案1、2、3）進行病毒增殖；在優化各參數時，其他對應參數固定不變。接毒24 h后，每隔6 h取樣測定TCID50[4]，持續取樣到84 h，分別繪制病毒增殖曲線。

1.6HP-PRRSV懸浮培養工藝重復性驗證利用1.5試驗中（1）～（5）篩選確定的病毒增殖參數，對HP-PRRSV（JXA1-R株）的增殖進行驗證，連續重復3批。

1.7HP-PRRSV懸浮培養逐級放大工藝研究與驗證以優化好的Marc-145細胞懸浮培養工藝在BC-7L生物反應器中進行Marc-145細胞懸浮培養，按生物反應器常規轉罐技術操作，轉入BSISL-42L生物反應器進行二級培養，細胞培養密度達到要求后，再入BC-100L生物反應器進行三級培養。待BC-100L生物反應器細胞密度符合要求時，按優化確定的HP-PRRSV懸浮培養參數進行接毒與病毒培養，接毒48 h后每隔6 h進行取樣測定病毒含量，監測病毒增殖情況。按照以上方法重復開展3批HP-PRRSV懸浮培養工藝驗證。

2　結果

2.1病毒最佳接毒時間確定3批懸浮培養的Marc-145細胞分別在細胞生長的第3天、4天、5天接毒，繪制3批病毒增殖曲線見圖1，細胞生長3日觀察，長滿單層，但不致密，細胞數為1.49×106個/mL，此時接毒進行HP-RRSV增殖，毒價整體較低。細胞生長4日后細胞數為2.43×106個/mL，培養第5天細胞數為2.78×106個/mL。從病毒增殖曲線可以看出，細胞生長3日后接毒和4、5日后接毒病毒增殖曲線差異顯著，細胞生長4日后和5日后接毒病毒增殖曲線差異不顯著。而細胞生長5天后代謝產物較第4天多，死細胞數量增加，生產周期延長。本試驗確定最佳接毒時間為細胞生長第4天。

圖1　不同時間接種HP-PRRSV病毒增殖曲線

2.2病毒增殖接毒劑量優化分別以不同MOI接種HP-PRRSV，接毒后不同時間取樣繪制4批病毒增殖曲線見圖2，從曲線圖上可以看出接毒劑量MOI=0.1時，病毒增殖效果最佳，與其他接毒劑量方案的病毒增殖曲線相比差異顯著。接毒后72 h病毒效價達到最高峰，隨后病毒效價出現降低。

圖2　不同接種HP-PRRSV劑量病毒增殖曲線

2.3病毒增殖維持液血清濃度優化以不同血清濃度的DMEM作為維持液，接毒后不同時間取樣繪制病毒增殖曲線見圖3。從病毒生長曲線看出，維持液血清濃度為2%和4%的病毒效價較1%高，差異顯著。2%血清濃度與4%血清濃度病毒增殖曲線相近，差異不顯著。但考慮生產實際的成本問題，本試驗確定最佳維持液血清濃度為2%。

圖3　不同血清濃度實驗病毒增殖曲線

2.4病毒增殖最佳溶氧參數確定以不同DO值進行病毒增殖，接毒后不同時間取樣繪制病毒增殖曲線見圖4。從病毒增殖曲線看出，當DO值為40%以上時病毒增殖效價高于30%，差異顯著。與50%時病毒增殖效價相近，無顯著差異。考慮生產成本因素，確定40%的DO值為病毒增殖的最佳溶氧參數。

圖4　DO值參數影響病毒增殖曲線

2.5病毒增殖溫度優化以不同病毒培養溫度進行病毒增殖，接毒后不同時間取樣繪制病毒增殖曲線見圖5。從病毒增殖曲線看出，35℃的病毒增殖效果最差，差異極顯著。36℃和37℃病毒增殖曲線相近，無顯著差異。考慮到環境溫度變化對細胞有一定影響，選用37℃為最佳培養溫度。

2.6病毒增殖最優參數重復驗證驗證結果見圖6。圖中可見3批病毒增殖曲線較為接近，毒價最高達到108.5TCID50/mL，最佳收毒時間為接毒后70～74 h，3批次病毒培養參數重復驗證結果無顯著差異。

2.7HP-PRRSV懸浮培養逐級放大工藝研究工藝放大和重復驗證結果顯示，病毒增殖情況良好，增殖趨勢一致。在接毒70～74 h內病毒增殖達到高峰，且病毒含量均不低于108.0TCID50/mL。批間培養效果差異不顯著。病毒增殖曲線見圖7。

3　討論

應用新型現代化的細胞懸浮培養工藝制造動物疫苗抗原是當前我國動物疫苗的主流發展趨勢之一。豬繁殖與呼吸綜合征作為我國核心的動物疫病之一，其疫苗生產工藝的懸浮化對于提高產品質量、降低生產成本具有重要的意義。HP-PRRS弱毒活疫苗因具有比滅活疫苗抗體產生快、持續時間長、保護力強等[5-6]諸多優點，已成為我國目前預防豬繁殖與呼吸綜合征的主要疫苗產品。本研究通過對HP-PRRSV疫苗毒懸浮培養工藝研究，摸索出科學、穩定的PRRSV細胞懸浮培養工藝替代現有的轉瓶培養工藝，克服其病毒培養效價低、批間差異大、污染因素多、難于控制等缺陷[7]，顯著提高HP-PRRSV半成品培養效價和生產效率，為最終全面提高HP-PRRSV活疫苗質量奠定基礎。

圖6　病毒增殖工藝驗證病毒增殖曲線圖

圖7　BC-100L生物反應器培養HP-PRRSV病毒增殖曲線圖

本試驗基于Marc-145細胞懸浮培養的技術上開展高致病性豬繁殖與呼吸綜合征懸浮培養工藝研究。系列試驗結果顯示，在Marc-145細胞微載體懸浮培養的第4天按照MOI=0.1的劑量接毒，接毒后以2%新生牛血清的維持液進行維持培養，以40%溶氧量在37℃進行病毒增殖，可以在接毒后70～74 h收獲到高效價HP-PRRSV病毒液，病毒效價在108.0TCID50/mL以上，最高效價可達108.5TCID50/mL，比傳統轉瓶工藝制備的HPPRRSV抗原效價提高了10倍以上。為適應大規模生產，本試驗還進行了懸浮工藝放大研究，在BC-100L生物反應器中連續培養的3批HPPRRSV，病毒增殖曲線與BC-7L培養的病毒增殖曲線相近，在接毒后72 h左右達到病毒效價高峰，病毒含量均不低于108.0TCID50/mL，證實了該懸浮培養工藝的穩定性和可放大性。本次工藝放大和重復性驗證過程中3次培養的病毒增殖曲線雖然整體趨勢一致，且培養效果均達到了預期水平，但在同一采樣時間點上的病毒效價測定結果仍然存在一定差異（<0.5TCID50/mL），經分析造成這種差異的可能原因是：不同批次各采樣時間點樣品在測定TCID50時的系統誤差及結果判定時人為誤差導致的，后續仍需要通過生產及檢驗控制加以改進。

本試驗利用微載體懸浮培養技術適用于多數貼壁細胞培養的特點，在細胞培養液中添加微載體，讓細胞貼附在微載體表面進行生長，可以有效提高單位體積內的細胞量，提高接種病毒效價。高效價的半成品抗原，可以通過稀釋進行配苗，對產品質量穩定性提供了有效保障，同時可以減少每頭份疫苗中雜蛋白含量，減少疫苗免疫的副反應。無論是對產品質量的提升以及對成本的控制，細胞懸浮培養技術與傳統轉瓶培養工藝相比都具有較大的優勢[8]。

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Study on the Process of Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus（HP-PRRSV J XA1-R strain）Microcarrier Suspension Culture

XU Hong-jun1，2，HAN Tao3，YUE Feng-xiong2，ZHOU Zhi3，SHU Jing-xiang2，ZHAI Xin-yan3，HU Lai-gen2，YANG Han-chun1
（1.China agricultural university college of Veterinary Medicine，Beijing 100193，China；2.Chengdu Teck-bank bio-products co.，LTD，Chengdu 610100，China；3.Chinese animal disease center，Beijing 100125，China）

Abstract：To increase the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus（HP-PRRSV）titer by the es?tablishment of Marc-145 cell microcarrier suspension culture process.The optimal tests for HP-PRRSV inoculated timeand quanti?ty，serum concentration of maintaining medium dissolved oxygen（DO），and culture temperature were performed on microcarrier suspension cultured Marc-145 cells in BC-7L bioreactor.The optimized parameters were also verified in BC-100L bioreactor fol?lowing Marc-145 cell suspension culture amplifying process.The results showed that the best viral inoculation time was 4 h after Marc-145 cell suspension culture，and the best viral inoculation quantity was 0.1 of MOI.The suspending cells were cultured with DMEM medium containing 2% of newborn calf serum at 37℃and the DO parameter was set to 40%.The viral proliferation curves of HP-PRRSV in BC-100L bioreactor were similar to that in BC-7L biological reactor .The viral titer peak appeared around 72 h after inoculation and the viral titer was more than 108.0TCID50/mL.HP-PRRSV suspension culture process is stable and can be used to produce large-scale virus particles in BC-100L bioreactor.

Key words：HP-PRRSV；Microcarrier；Biological Reactor；Suspension Culture Corresponding author：YANG Han-chun

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0024-04

收稿日期：2016-01-20

作者簡介：徐宏軍（1975-），男，獸醫師，博士，從事動物疫苗研發工作，E-mail：5401737@qq.com

通訊作者：楊漢春，E-mail：yanghanchun1@cau.edu.cn