豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達與間接ELISA方法建立

楊嘉玉，韋　莉，王　菁，侯　磊，全　榮，朱珊珊，閻　旭，李子璇，劉　超，劉　爵

（1.北京農學院動物科技學院，北京昌平102206；2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京海淀100097）

YANG Jia-yu1，2，WEI Li2，WANG Jing2，HOU Lei2，QUAN Rong2，ZHU Shan-shan2，YAN Xu2，LI Zi-xuan2，LIU Chao1，2，LIU Jue2（1.Animal Science and Techolagy College，Beijing University Of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

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豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達與間接ELISA方法建立

楊嘉玉1，2，韋莉2，王菁2，侯磊2，全榮2，朱珊珊2，閻旭2，李子璇2，劉超1，2，劉爵2

（1.北京農學院動物科技學院，北京昌平102206；2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京海淀100097）

摘要：為了檢測豬群中豬流行性腹瀉（PED）抗體水平，用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統，構建含有PEDV N基因的重組桿狀病毒rBac-PEDV N并在昆蟲細胞中獲得表達。用純化的重組N蛋白作為包被抗原，建立了檢測PEDV抗體的間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法。與Western Blot的符合率為91.3%，說明該方法適用于PED的臨床診斷。

關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；N蛋白；Bac-to-Bac桿狀病毒表達；間接ELISA

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性高度接觸性豬腸道傳染病，主要臨床特征表現為水樣腹瀉、脫水、嘔吐和哺乳仔豬高度致死。由于變異毒株的出現，使得流行強度增大，病情更為復雜，引起了業界的廣泛關注，但目前尚無商品化病毒血清檢測試劑盒。PEDV編碼的N蛋白在PEDV的結構蛋白中所占比例最大，而且在同種病毒之間具有高度的保守性[1]。同時，N蛋白還具有較強的抗原性，可以誘導宿主的細胞免疫和體液免疫，在病毒感染早期，豬體能迅速產生抗N蛋白抗體。鑒于N蛋白的特點，本研究利用桿狀病毒表達系統表達PEDV N蛋白，并用純化的N蛋白作為包被抗原，建立檢測血清樣品的PEDV間接ELISA方法，用于PEDV急性或感染早期的快速診斷具有很好的應用前景[2-4]。

1　材料與方法

1.1主要材料豬流行性腹瀉糞樣、PEDV陽性及陰性血清、大腸桿菌宿主菌DH10Bac、Sf9昆蟲細胞和載體pFastBacHTA由本實驗室保存；限制性內切酶BamH I、Xhol I、T4 DNA連接酶，購自NEB公司；RNeasy Mini Kit、Gel Extraction Kit、Plas?mid Mini Kit，購自QIAGEN公司；CellfectinⅡRe?agent和ProBond Purification System試劑盒，購自Invitrogen公司；HRP標記的兔抗鼠及兔抗豬IgG、FITC標記的兔抗鼠IgG，購自Sigma公司。

1.2重組N蛋白的表達與純化用RT-PCR方法擴增PEDV N基因與pFastBacHTA載體連接，獲得桿狀病毒轉移載體pFastBacHTA-PEDVN。隨后，將其轉化至DH10Bac感受態細胞中，獲得桿狀病毒重組質粒Bacmid-PEDVN。將其轉染昆蟲細胞Sf9，通過IFA鑒定，獲得表達N蛋白的重組桿狀病毒并命名為rBac-PEDVN。將rBac-PEDVN連續感染昆蟲細胞并純化重組N蛋白，隨后經SDSPAGE和Western Blot對純化蛋白進行分析。

1.3間接ELISA方法反應條件的優化及cut-off值的確定以純化的N蛋白作為包被抗原，用棋盤法確定蛋白最佳包被濃度和陰、陽性血清最佳稀釋度，同時對包被條件、封閉條件、血清作用時間、酶標二抗工作條件及底物作用時間進行逐一優化，確定最佳反應條件。按最佳反應條件，對50份PEDV陰性血清進行檢測，測得A450值。根據統計學分析，計算平均數（X）和標準差（SD），確定cut-off值。

1.4特異性試驗用建立的方法，對PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、TGEV陽性血清進行檢測，確定包被抗原與其他常見豬傳染病的陽性血清是否發生交叉反應。

1.5敏感性試驗將10份PEDV陽性血清從1∶200開始進行倍比稀釋至1∶3 200進行檢測，根據判斷標準，對各A450值進行判斷。

1.6重復性試驗取8份陽性血清和2份陰性血清，用同一批次純化的N蛋白包被ELISA板進行檢測，再用不同批次純化的N蛋白包被ELISA板進行檢測，計算批內批間變異系數。

1.7比較性試驗取PEDV陽性血清32份和陰性血清48份，同時用已建立的間接ELISA方法和Western Blot方法進行檢測，計算該間接ELISA方法的符合率。

1.8臨床應用用建立的間接ELISA方法對采集的586份臨床血清樣品進行快速檢測。

2　結果

2.1重組N蛋白的表達與純化通過桿狀病毒表達系統成功獲得在Sf9昆蟲細胞中表達N蛋白的重組桿狀病毒，利用anti-His-tag單克隆抗體進行間接免疫熒光檢測，結果顯示，rBac-PEDVN感染的Sf9細胞內出現特異性綠色熒光（見中插彩版圖1-a），而對照Sf9細胞內無特異性綠色熒光出現（見中插彩版圖1-b），將純化的目的蛋白經SDS-PAGE和Western Blot分析，結果顯示，在分子量61 kD處出現單一條帶且與預期目的條帶大小相符（圖2），同時，利用anti-His-tag單克隆抗體和PEDV陽性血清進行Western Blot檢測，在目的位置均出現特異性的條帶（圖3 A1，B2），而陰性對照無條帶顯現（圖3 A2，B1）。

圖3　Western Blot檢測純化的目的蛋白

2.2PEDV N蛋白間接ELISA方法相關條件的確定最佳條件判斷標準為：陽性血清A450值接近于1，陰性血清A450值較小，且陽性與陰性A450的P/N值最大的孔所對應的反應條件。通過棋盤法獲得以80 ng/孔純化的N蛋白包被酶標板4℃過夜；PBST緩沖液洗滌3次，3 min/次；5%脫脂奶封閉1 h；洗滌后，血清樣本1∶200稀釋作用1 h；洗滌后，二抗1∶5 000稀釋作用30 min；洗滌后，TMB顯色液作用10 min，讀取A450數值為ELISA方法反應的最佳條件。50份PEDV陰性血清樣品經間接ELISA方法測定后，計算得陰性血清A450的平均值X為0.1096，標準差SD為0.0255，則cut-off值為0.186。因此，當樣本A450值大于或等于0.186時，判為陽性，反之陰性。

2.3特異性試驗結果用間接ELISA方法對5種常見豬傳染病的陽性血清進行檢測，A450值均小于0.186，呈陰性反應（圖4），表明PEDV N蛋白不與其他豬傳染病陽性血清發生交叉反應，具有較好的特異性。

圖4　特異性試驗結果

2.4敏感性試驗結果檢測10份稀釋的陽性血清，當血清稀釋至1 600時，A450值均大于0.186，呈陽性反應（圖5），證明所建立的間接ELISA方法具有較好的敏感性。

圖5　敏感性試驗結果

2.5重復性試驗結果批內重復性試驗和批間重復性試驗結果表明，批內變異系數為2.18%～4.276%，批間變異系數為1.35%～6.41%，均小于10%，表明所建立的ELISA方法變異系數均在可接受的范圍內，試驗具有可重復性。

2.6比較性試驗結果用建立的間接ELISA方法與Western Blot方法分別平行測定32份PEDV陽性血清和48份陰性血清，對檢測結果進行比較，結果顯示間接ELISA方法和Western Blot方法的符合率為91.3%（表1）。

表1　兩種生物學方法敏感性和特異性的比較

2.7臨床血清樣品的檢測用已建立的ELISA方法檢測從不同地方采集的586份豬血清，結果血清陽性率在47%～100%之間，總體陽性率為92%。

3　討論

鑒于PEDV給養豬業帶來重大的經濟損失，建立快速、準確的診斷方法頗為急需。Hofmann 和Wyler[5]首次應用全病毒包被的ELISA方法對PEDV感染情況進行了血清學調查。然而，該病毒適應細胞難不利大量制備診斷抗原，并且細胞毒中細胞成分會對抗體檢測產生非特異性干擾，影響檢測的特異性[6]。Hou等[7]利用原核表達系統表達了PEDVN蛋白，并用重組的N蛋白建立了檢測PEDV血清抗體的ELISA方法。本試驗所采用的桿狀病毒表達系統可對外源基因產物進行各種翻譯后修飾，較原核表達系統更容易獲得具有正確結構和修飾的活性蛋白[8-10]。所以，利用該系統表達的重組PEDV N蛋白更接近天然蛋白。

間接ELISA方法成功的關鍵在于抗原的純度，為純化出高純度的蛋白，我們通過確定最佳接毒劑量、接毒時間、增加洗滌次數、改變洗脫液的pH值等方法來解決。通過一系列的條件優化確定了ELISA的反應條件并初步成功應用于臨床血清樣品的檢測，為PEDV的診斷研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Kocherhans R，Bridgen A，Ackermann M，et al . Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus（PEDV）genome se?quence[J].Virus genes，2001，23（2）：137-144.

[2] Cologna R，Spagnolo J F，Hogue B G.Identification of nucleocap?sid binding sites within coronavirus-defective genomes[J] .Virolo?gy，2000，277（2）：235-249.

[3] Rodak L，Valicek L，Smid B，et al.An ELISA optimized for por?cine epidemic diarrhoea virus detection in faeces[J] . Veterinary microbiology，2005，105（1）：9-17.

[4] Song D，Park B.Porcine epidemic diarrhoea virus：a comprehen?sive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines [J].Virus genes，2012，44（2）：167-175.

[5] J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南[M].金冬雁，黎孟楓，等譯.北京：科學出版社，1993.

[6] Hofmann M，Wyler R . Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of porcine epidemic diarrhea coronavirus antibodies in swine sera[J].Veterinary microbiology，1990，21（3）：263-273.

[7] Hou X L，Yu L Y，Liu . Development and evaluation of enzymelinked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea（PEDV）anti?bodies[J].Veterinary microbiology，2007，123（1-3）：86-92.

[8] Miller L K . Baculoviruses for foreign gene expression in insect cells[J].Biotechnology（Reading Mass），1988，10：457-465.

[9] Ailor E，Betenbaugh M J . Modifying secretion and post-transla?tional processing in insect cells[J].Current opinion in biotechnolo?gy，1999，10（2）：142-145.

[10] Hitchman R B，Possee R D，King L A . Baculovirus expression systems for recombinant protein production in insect cells[J] . Re?cent patents on biotechnology，2009，3（1）：46-54.

Development of an indirect ELSA based on recombinant porcineepidemic diarrhea virus nucleocapsid protein by Bac-to-Bac baculovirus expression system

YANG Jia-yu1，2，WEI Li2，WANG Jing2，HOU Lei2，QUAN Rong2，ZHU Shan-shan2，YAN Xu2，LI Zi-xuan2，LIU Chao1，2，LIU Jue2
（1.Animal Science and Techolagy College，Beijing University Of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

Abstract：To determine the level of antibody against PEDV in swine，the recombinant baculovirus rBac-N containing PEDV N gene was constructed and the expressed N protein in insect cell was obtained by Bac-to-Bac baculovirus expression system .An indirect ELISA method was developed to detect anti-PEDV antibody using the purified N protein as coating antigen .The coinci?dence rate was 91.3% when comparing with Western blot，and it could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis.

Key words：PEDV；nucleocapsid（N）protein；Bac-to-Bac baculovirus expression；ELISA Corresponding author：LIU Jue

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0021-03

收稿日期：2016-01-08

基金項目：北京市農林科學院科技創新能力建設專項（KJCX-20161503）

作者簡介：楊嘉玉（1990-），女，碩士生，主要從事畜禽疾病診斷與防治，E-mail：yangjiayu1211@163.com

通訊作者：劉爵，E-mail：liujue@263.net