脂多糖誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中炎性因子和核轉(zhuǎn)錄子-κB的表達(dá)

朱麗萍，楊文浩，任婷婷，叢　霞，李華濤，曹榮峰，劉楚君，田文儒（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

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脂多糖誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中炎性因子和核轉(zhuǎn)錄子-κB的表達(dá)

朱麗萍，楊文浩，任婷婷，叢霞，李華濤，曹榮峰，劉楚君，田文儒
（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

摘要：試驗(yàn)預(yù)探索脂多糖（LPS）刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生時(shí)間、濃度以及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活情況。用酶消化法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bMEC）；CCK-8法篩選LPS最佳刺激濃度（IR≤10%），并用其處理對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的bMEC。ELISA試劑盒檢測(cè)0～24 h不同處理時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-1β表達(dá)變化，以確定炎癥模型是否建立成功；用Western-Blot檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p-p65和p65）及其抑制蛋白（p-IκBα和IκBα）的表達(dá)。結(jié)果顯示，用酶消化法成功培養(yǎng)原代bMEC；CCK-8法篩選LPS的最佳致炎濃度為1 μg/mL；LPS處理后3～24 h可極顯著增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TNF-α和IL-1β表達(dá)，并在處理后15 min極顯著提高bMEC中p-p65和p-IκBα的表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明，LPS能夠在3～24 h內(nèi)有效誘導(dǎo)bMEC炎癥模型的建立，并能在15 min時(shí)活化奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路。

關(guān)鍵詞：奶牛乳腺上皮細(xì)胞；脂多糖；TNF-α；IL-1β；NF-κB

奶牛乳腺炎是對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一，不僅使奶牛產(chǎn)奶量下降，還影響乳品質(zhì)量、危害食品衛(wèi)生安全。大腸桿菌等革蘭陰性菌是乳腺炎常見(jiàn)的致病菌，脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的特殊成分，能夠使宿主機(jī)體組織器官受到損傷[1]。NF-κB能夠調(diào)節(jié)與炎癥、免疫密切相關(guān)的細(xì)胞介質(zhì)，如細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等[2]。因此，抑制NF-κB的活性被認(rèn)為是控制炎癥、免疫反應(yīng)的有效方法[3]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞是乳腺防御病原菌入侵的第一防線，起到了重要的免疫防御作用[4]。炎癥發(fā)展有不同的階段，在炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈時(shí)用藥具有最佳的治愈效果，而有關(guān)LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生和通路激活時(shí)間鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)LPS處理原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥模型，并觀察LPS刺激后炎性因子和NF-κB通路的表達(dá)變化，以進(jìn)一步確定炎癥反應(yīng)的時(shí)間和程度，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1　試驗(yàn)材料

LPS（Sigama，O111：B4）；牛腫瘤壞死因子α （TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒和牛白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Anti-Cytoκeratin 18抗體（ab668）、p-IκB-α抗體（ab12135）、IκB-α抗體（ab49978）和Anti-NF-κB p65抗體（ab90532），均購(gòu)自Abcam；p-NF-κB-p65抗體（sc-33020），購(gòu)自Santa cruz。

2　試驗(yàn)方法

2.1奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定將奶牛新鮮的乳腺組織剪成乳糜狀，再分別用0.25%I型膠原酶和0.25%胰酶分步消化，以3 000 r/min離心15 min后，加入培養(yǎng)基終止消化，37℃恒溫培養(yǎng)。參照多曙光等[5]方法，并加以改進(jìn)，利用兩種細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感性不同進(jìn)行純化。

將原代細(xì)胞接種于蓋玻片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行免疫組化鑒定。PBS沖洗、95%乙醇固定、10%山羊血清封閉、加入鼠抗牛一抗CK18（1∶200）、山羊抗鼠二抗（1∶3 000），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，顯微鏡鏡檢。

2.2奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型的建立

2.2.1CCK-8法篩選LPS最佳作用濃度將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行96孔鋪板，培養(yǎng)6 h，細(xì)胞貼壁后，設(shè)空白對(duì)照組和LPS（0.01、0.1、1 μg/mL和10 μg/mL）處理組，每組6個(gè)重復(fù)。將處理后細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入CCΚ-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，450 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。用下列公式計(jì)算出其抑制率（IR），IR=（OD空白-OD模型）/OD空白×100%（OD=吸光值）。以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率小于或最接近10%為篩選濃度的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行96孔鋪板，根據(jù)CCK-8確定的LPS濃度處理細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組與LPS模型組（分別處理3、6、12 h和24 h），每組6個(gè)重復(fù)。按照ELISA試劑盒的操作要求進(jìn)行TNF-α和IL-1β的檢測(cè)。

2.3NF-κB的檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代，根據(jù)CCK-8確定的LPS濃度處理細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組、LPS模型組（分別處理15、30、60 min和180 min），每組3個(gè)重復(fù)。4℃下提取細(xì)胞蛋白，12 000 r/min離心5 min，取上清。加入5× SDS上樣緩沖液，加熱變性進(jìn)行凝膠電泳，4℃條件下220 mA恒流濕轉(zhuǎn)2 h，封閉2 h，兔抗牛一抗（1∶800）孵育12 h、山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育1 h，ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)，AlphaView軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

2.4數(shù)據(jù)分析采用GraphPadPrism5.01軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異用Dunnett單因素方差分析，均數(shù)間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果與分析

3.1奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定細(xì)胞生長(zhǎng)初期伴有少量成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，二者之間生長(zhǎng)界限明顯；隨著純化次數(shù)的增多，成纖維細(xì)胞逐漸消失，上皮細(xì)胞成片生長(zhǎng)，細(xì)胞呈典型的鋪路石狀，胞核呈圓形或橢圓形。免疫組化鑒定在加入CK-18抗體后，胞漿呈棕黃色（見(jiàn)中插彩版圖1，B），細(xì)胞核采用蘇木精復(fù)染，呈現(xiàn)紫紅色。陰性對(duì)照組未加入角蛋白-18抗體（見(jiàn)中插彩版圖1，A），胞漿呈現(xiàn)透明狀。

3.2乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型建立

3.2.1LPS對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的毒性作用根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，LPS致炎的最佳濃度為1 μg/mL，抑制率為8.9%（表1）；隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。

表1　LPS對(duì)bMEC生長(zhǎng)的抑制作用

3.2.2ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-1β的表達(dá)LPS能夠極顯著提高TNF-α、IL-1的表達(dá)量（P<0.01）并呈時(shí)間依賴性（圖2）。TNF-α和IL-1β分別在LPS刺激后的6 h和12 h達(dá)到峰值。以上結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)1 μg/mL的LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞不同時(shí)間后，早期促炎因子TNF-α和IL-1β表達(dá)發(fā)生顯著差異，奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型建立成功。

3.2.3LPS對(duì)NF-κB通路的表達(dá)的影響結(jié)果顯示，LPS可以誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞胞漿中IκBα的磷酸化，使得細(xì)胞核中p-IκB-α表達(dá)量增多并進(jìn)一步活化p65，促進(jìn)其發(fā)生核移位，使得細(xì)胞核中p-p65表達(dá)量增多。并與時(shí)間呈依賴性p-IκB-α/IκB-α最高值出現(xiàn)在LPS刺激15 min后（圖3， B）；p-p65/p65最高值出現(xiàn)在LPS刺激30 min后（圖4，B）。3 h后二者的表達(dá)量均逐漸降低，但仍然極顯著高于0 min組。

圖2　LPS刺激不同時(shí)間TNF-α、IL-1β的表達(dá)量

圖3　LPS刺激不同時(shí)間p-IκB-α/IκB-α的比值

圖4　LPS刺激不同時(shí)間p-p65/p65的比值

4　討論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要組成成分，是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞毒性因子。TNF-α和IL-1β是急性炎癥早期的細(xì)胞因子，是衡量炎癥模型建立與否的標(biāo)志[6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)1 μg/mL LPS處理3 h后早期促炎因子TNF-α與IL-1β均已極顯著升高（P<0.01），表明奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型建立成功。而付靈梅[7]等用100 ng/mL LPS刺激人的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，在48 h后成功建立炎癥模型。由于不同細(xì)胞對(duì)不同血清型LPS的敏感度不同，以及刺激時(shí)間的不同，在誘導(dǎo)建立炎癥模型時(shí)會(huì)出現(xiàn)LPS濃度差異。有研究報(bào)道，TNF-α的基因表達(dá)在LPS刺激后3 h達(dá)到峰值，峰值大約是平時(shí)水平的47倍[8]。IL-1β是繼TNF-α之后分泌的另一種細(xì)胞因子，一般認(rèn)為其表達(dá)的升高與TNF-α的表達(dá)相平行[9]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α的蛋白表達(dá)在LPS刺激后6 h達(dá)到峰值，IL-1β的蛋白表達(dá)在LPS刺激后12 h達(dá)到峰值，分析可能是由于基因和蛋白表達(dá)的差異性所致。

在細(xì)胞中NF-κB主要以p50/p65異源二聚體形式存在[10]。在靜息狀態(tài)時(shí)，p50/p65二聚體與其抑制性蛋白IκB結(jié)合形成三聚體，以非活性的復(fù)合物形式滯留于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到LPS等因素刺激后，IκB迅速磷酸化并與p50/p65二聚體分離，p50/p65二聚體由胞質(zhì)入胞核，引起下游炎性因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)[11]。NF-κB信號(hào)通路的激活是以p65的核移位和IκB的磷酸化為標(biāo)志[12]。由此我們通過(guò)選擇p-p65/p65和p-IκBα/IκB-α作為研究的對(duì)象，在不同的時(shí)間段加入LPS刺激，觀察IκBα與p65的磷酸化程度與時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示，LPS刺激15 min時(shí)，p-IκBα/IκBα和pp65/p65含量均明顯升高，這說(shuō)明LPS在刺激15 min時(shí)就能夠有效活化奶牛乳腺上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路，但炎性因子在LPS刺激的3 h后才有顯著表達(dá)，與p-IκBα和p-p65的表達(dá)時(shí)間并不一致，說(shuō)明可能炎癥發(fā)生時(shí)需要先激活炎癥信號(hào)通路，然后才表達(dá)炎性因子。但是NF-κB在激活后究竟如何調(diào)控下游細(xì)胞因子的表達(dá)還有待于進(jìn)一步研究。此外，本試驗(yàn)結(jié)果是在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞上獲得的，至于在體內(nèi)LPS是否會(huì)有同樣的作用，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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The Expression of NF-κB and IκB-α Induced by LPS in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHU Li-ping，YANG Wen-hao，REN Ting-ting，CONG Xia，LI Hua-tao，CAO Rong-feng，LIU Chu-jun，TIAN Wen-ru
（College of Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Abstract：The aims of this study were to explore the expression of inflammatory cytokines and activation of NF-κB signal pathway in primary bovine mammary epithelial cells（bMEC）after lipopolysaccharide（LPS）stimulation.The bMECs were enzymati?cally digested and method of CCK-8 was used to ascertain the suitable dose of LPS（IR≤10% as the standard）for stimulating the bMECs in their exponential growth phase.The concentrations of TNF-α and IL-1β in cellular supernatants were detected by ELI?SA kits at 0～24 h after LPS treatment to determinate the establishment of the cellular inflammation model.The expressions of NF-κB（p-p65 and p65）and（p-IκBα and IκBα）were detected by using Western-Blot.Our results showed that bMECs were cultured successfully by using enzymatic digestion method .The optimal concentration of LPS for inducing inflammation screened by using CCK-8 was 1 μg/mL.LPS significantly increased the expressions of both TNF-α and IL-1β at 3～24 h and p-p65 and p-IκBα at 15 min after treatment in bMECs.Our data suggest that LPS induces inflammation in bMECs at 3～24 h while the NF-κB sig?naling pathway is activated at 15 min after treatment.

Key words：Bovine mammary epithelial cells；LPS；TNF-α；IL-1β；NF-κB

中圖分類號(hào)：S823.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0014-05

收稿日期：2015-05-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31172378，31572590）；山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)崗位（SDAIT-12-011-03）

作者簡(jiǎn)介：朱麗萍（1989-），女，碩士生，從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：952394424@qq.com

通訊作者：田文儒，E-mail：wrtian@126.com

Corresponding author：TIAN Wen-ru