氯胺酮對大鼠海馬神經元ATP酶活性的影響

周　彤，曹馨方，陳　希，陳　蕊，劉　沫，張　宇，魏成威，吳　越，于東旭，劉子睿，姜仁禮，李欣然，王冠穎，肖建華，高　利（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030）

?

氯胺酮對大鼠海馬神經元ATP酶活性的影響

周彤，曹馨方，陳希，陳蕊，劉沫，張宇，魏成威，吳越，于東旭，劉子睿，姜仁禮，李欣然，王冠穎，肖建華，高利
（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：本試驗研究不同濃度氯胺酮對大鼠海馬神經元ATP酶活性的影響，并探討氯胺酮的中樞麻醉機制。體外培養懷孕16～18 d的胎鼠神經細胞，至第8天直接給予3種不同濃度的氯胺酮，使用超微量ATP酶測定試劑盒，檢測胎鼠海馬中ATP酶的活力。結果顯示，海馬中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性均受到不同程度的抑制，并且這種抑制作用的程度具有劑量依賴的趨勢。據此推測氯胺酮的麻醉機制可能與抑制海馬中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性有關。

關鍵詞：氯胺酮；麻醉；Na+-K+-ATP酶；Ca2+-Mg2+-ATP酶

在中樞神經系統中，參與跨膜信號轉導的ATP酶（Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶）的活性與中樞神經系統功能活動關系密切，它們對維持細胞的正常生理功能起著極其重要的作用[2，4，7，9-10]。海馬作為邊緣系統中一個重要組成部分，在維持神經系統功能中起著重要的作用。氯胺酮是苯環己哌啶的衍生物，屬于靜脈全身麻醉藥，臨床上用作手術麻醉劑或麻醉誘導劑，具有一定的精神依賴性。本試驗體外培養大鼠海馬神經細胞，通過研究不同濃度氯胺酮對其ATP酶活性的影響，探討氯胺酮對神經細胞的抑制作用。

1　試驗材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠39只，體重200±20 g，雌雄兼備，孕16～18 d Wistar大鼠3只。購自哈爾濱醫科大學。

1.2試驗器材與試劑Waters600高效液相色譜系統、色譜柱Symmetry C18（4.6×150 mm，5 μm）、細胞培養箱（Thermo公司）、75 μm細胞濾網。氯胺酮（沈陽市獸藥廠，20110908）、Mouse anti-MAP2antibody（Cat.no.13-1500）、細胞裂解液（北京賽馳生物科技有限公司）、蛋白定量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、考馬斯亮蘭蛋白質含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）等。

1.3實驗方法

1.3.1神經細胞培養、鑒定將Wistar孕鼠手術常規斷頸處死，從子宮中取出胎鼠，取出大腦浸入Hank's平衡鹽溶液（含10 mmol/L HEPES、1 mmol/L丙酮酸鈉）中。分離海馬，用Hank's平衡鹽溶液漂洗3次，將海馬組織剪碎至1 mm3大小左右。0.25%胰酶37℃消化5～10 min，室溫孵育5 min；分別用Hank's平衡鹽溶液、BEM培養基（含10% FBS、4 500 mg/L葡萄糖、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 IU/mL青霉素、0.1 μg/mL鏈霉素）漂洗2次后于BEM培養基中重懸，細胞計數后接種于聚左旋賴氨酸包被的6孔板中，5% CO2、37℃培養，24～48 h后加入阿糖胞苷。每周兩次用Neurobasal medium培養基（含B-27、4.0 μmol/L L-谷氨酰胺、10 IU/mL青霉素、0.1 μg/mL鏈霉素）進行半換液，維持神經細胞生長。

神經元的鑒定方法：MAP-2免疫熒光方法：4%多聚甲醛/蔗糖混合物室溫固定10 min；0.1% TritonX-100室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次；5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，甩去多余液體，滴加一抗，4℃過夜，0.01 mol/L PBS漂洗3次；生物素化二抗室溫孵育1 h，0.01 mol/L PBS漂洗3次；抗褪色封片劑封片，熒光顯微鏡觀察結果。

1.3.2細胞給藥濃度檢測大鼠39只，隨機分為低劑量組（D組），麻醉組（M組），高劑量組（G組）。D組腹腔注射氯胺酮10、20、30、40 mg/kg，M組腹腔注射氯胺酮50、60、70、80、90、100 mg/kg，G組腹腔注射氯胺酮150、200、300 mg/kg，每個濃度3個平行，心臟采血，高效液相色譜法（HPLC）檢測血藥濃度，確定氯胺酮細胞給藥濃度范圍。

1.3.3ATP酶活性測定根據氯胺酮在大鼠麻醉過程中的血藥濃度檢出值，確定氯胺酮作用于神經細胞的濃度為0.7 μg/mL、1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL。在神經細胞培養第八天進行細胞加藥，每個濃度設置3個平行試驗，分別在加藥的0、5、10、15、20、25、30、45、60、90、120 min對細胞進行裂解，取裂解后的細胞液，用ATP酶活力的檢測試劑盒進行檢測。

2　結果

2.1神經元的培養及鑒定結果

2.1.1形態學觀察細胞懸液接種在培養板3 h鏡下觀察，培養板上細胞碎片較少，貼壁的神經細胞大小均一，胞體為圓形，分散均勻，且折光度好，包體周圍有光暈包圍（圖1-a）；在培養至第4天，從形態學上觀察未見其他雜質細胞，神經元胞體變長，形態隨突起的方向延伸，折光度好，細胞間隱約出現突起交織狀（圖1-b）；在培養至第8天，胞體成熟，折光度強，突起充分延展且清晰，并且相互交織成網絡且密集，特征形態明顯（圖1-c）。

圖1　大腦海馬神經元體外培養3 h（a），4 d（b），8 d（c）鏡下觀察（倒置顯微鏡20×10）

2.1.2神經細胞鑒定結果EVOS倒置熒光顯微鏡下觀察：神經元細胞培養第8天，MAP-2免疫熒光鑒定下，神經元呈熒光綠色，遍布于神經元胞體、軸突、樹突明顯清晰，延展充分，神經元之間交織呈網絡狀，呈典型的神經原細胞形態（圖2）。

2.2血漿氯胺酮濃度39只大鼠給藥，翻正反射消失后，心臟采血，血藥濃度檢測結果如表1。

2.3不同濃度氯胺酮對Na+-K+-ATP酶活性的影響如表2所示，在不同濃度氯胺酮的作用下，Na+-K+-ATP酶活性大體呈現先降低后升高的趨勢。0.7 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞后，從10 min開始Na+-K+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05），而1 μg/mL、3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞后，從5 min開始Na+-K+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05）。0.7 μg/mL和1 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞120 min時，Na+-K+-ATP酶的活性恢復到對照組水平，3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞120min時，Na+-K+-ATP酶的活性仍沒有恢復。

2.4不同濃度氯胺酮對Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響如表3所示，在不同濃度氯胺酮的作用下，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性大體呈現先降低后升高的趨勢。0.7 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞后，從15 min開始Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05），而1 μg/mL、3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞后，從10 min開始Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性降低明顯，差異顯著（P<0.05）。1 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞90 min時，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性恢復到對照組水平，0.7 μg/mL、3 μg/mL和5 μg/mL的氯胺酮作用于神經細胞120 min時，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性恢復到對照組水平。

圖2　大腦海馬神經細胞體外培養8 d免疫熒光染色鏡下對比觀察

表1　不同注射劑量下大鼠血藥濃度（μg/mL，n=3）

表2　不同濃度氯胺酮對Na+-K+-ATP酶活性的影響（U/mLprot，n=3）

表3　不同濃度氯胺酮對Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響（U/mLprot，n=3）

3　討論

Na+-K+-ATP酶在維持細胞膜通透性、膜內外離子成分及維持細胞正常代謝等方面起重要作用。它能夠逆濃度梯度轉運Na+、K+，運出3個Na+的同時運入2個K+，從而維持細胞的正常生理功能，并對突觸之間的化學傳遞以及神經傳導功能的興奮性具有重要作用。徐恩等[1]通過研究推測Na+-K+-ATP酶可能參與了海馬神經元的保護。費劍春等[2]報道，麻醉狀態下大腦皮質內Na+-K+-ATP酶活性的降低與異氟醚、氯胺酮、氯丙嗪等藥物的中樞抑制作用存在密切聯系。細胞膜的Na+-K+-ATP酶的作用是降低細胞內Na+的水平，進而減少了細胞膜上Na+和Ca2+的交換，使神經細胞內Ca2+降低，從而維持鈣穩態[3]。Na+-K+-ATP酶活性受到抑制，可導致動作電位峰電流期間產生的膜內高Na+和膜外高K+的狀態不能及時消除，致使動作電位的后時相電位時程延長，細胞的相對不應期延長，興奮性產生的閾值大幅度增高，引起受抑制區域所支配的各項生理功能暫時性地減退乃至喪失，從而產生鎮靜、鎮痛、肌松和無記憶等麻醉效應[4-5]。

Ca2+-Mg2+-ATP酶是細胞膜上的Ca2+泵，可水解ATP，將胞內2個Ca2+運出的同時運進1個Mg2+，以維持細胞內較低濃度的Ca2+`，對維持細胞穩態具有重要作用。該酶的活力降低，可導致細胞內Ca2+濃度因泵受限而增高[6]，造成細胞內Ca2+超載，這是細胞損傷的機制之一。近年來，許多實驗表明靜脈麻醉藥、吸入麻醉藥、鎮靜藥和鎮痛藥均可以抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性[7-11]。Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受到明顯抑制后，神經細胞內多余的Ca2+不能及時轉運至膜外，導致細胞內游離型Ca2+濃度升高，鈣穩態失衡，從而影響神經細胞動作電位的產生與興奮性傳導，對中樞神經產生一定的抑制效應。另有研究證明，吸入麻醉藥可能是通過與酶蛋白結合[12]、直接抑制酶的活性部位[13]或作用于脂質和蛋白質相互作用的表面[14]來影響酶的活性。

本實驗結果中，不同濃度氯胺酮作用于神經細胞后均可對ATP酶跨膜信號轉導系統產生明顯的影響，與對照組相比差異顯著，在25 min或30 min ATP酶活性會降到最低，隨著時間的推移，酶活性會逐漸恢復，且氯胺酮的濃度越高對ATP酶的活性產生的影響越明顯，恢復的速度也越慢。

4　結論

麻醉濃度的氯胺酮直接作用于神經細胞后對Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶產生明顯的影響，且隨氯胺酮濃度的升高，ATP酶活性降低明顯，表明氯胺酮發揮麻醉作用可能與影響ATP酶的活性有關。

參考文獻：

[1]徐恩，彭文宏，詹麗璇.低氧預處理通過鈉鉀ATP酶對成年大鼠短暫全腦缺血保護[C].中華醫學會第十三次全國神經病學學術會議論文匯編，成都：2010.

[2]費劍春.Na+，K+-ATP酶及麻醉藥對其影響[J].國外醫學：麻醉學與復蘇分冊，2002，23（5）：291-293.

[3] Barber D，Hunt J，Ehrich M . Inhibition of calcium-stimulated ATPase in the brain P2 synaptosomal fraction by organophosphos?phorus esters：relevance to delayed neuropathy[J].J Toxicol Envi?ton Health A，2001，63（2）：101-113.

[4]陳君，王國林.離子通道理論與麻醉[J].天津醫藥，2003，31 （4）：261-264.

[5] Shantii N D，Desai P V.The Study of Na+-K+-ATPase Activity of Rat Brain during Crush Syndrome[J] . NeurochemicalResearch，2007，32（11）：1843-1848.

[6]趙亞麗，宋錦萍，楊玉華，等.不同強度微波輻射對小鼠腦組織鈣、鎂ATP酶活性的影響[J] .中華航空航天醫學雜志，2000，11（2）：101-104.

[7]劉悅張，瑾劉雅，任建軍，等.七氟醚后處理對大鼠心肌缺血再灌注時Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影響[J].中國麻醉學雜志，2010，30（10）：1179-1181．

[8]賈淑偉，李玉榮，楊玉玲，等.孤啡肽和嗎啡對大鼠皮層體感區Ca2+-ATP酶活性的影響[J].哈爾濱醫科大學學報，2004，38（2）：154-156．

[9] M Volpi，R I . Sha'Afi，P . M . Epstein，et al . Local anesthetic s，mepacrine，and propranolol are antagonists of calmodulin[J] .Pro?ceedings of the National Academy of Sciences，1981，78（2）：795-799．

[10]范宏剛，盧德章，胡魁，等.噻環乙胺對大鼠不同腦區突觸體Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的動態影響[J].中國獸醫雜志，2010，46（10）：89-91．

[11 Elena Garcia-Martin，Carlos Gutierrez-Merino. Local anesthetic s Inhibit the Ca2 +-Mg2 +-ATPase Activity of Rat Brain Synapto?somes[J].Journal of Neurochemistry，1986，47（3）：668-671．

[12] Janicki P K，Horn J L，Singh G，et al . Increased anesthetic re?quirement for isoflurane halothane enflurane and desflurane in obese rats are associated with insulin-induced stimulation of plas?ma membrane Ca2+-ATPase[J].Life Sci，1996，59（17）：269-275.

[13] Lopez M M，Kosk K D.Spectroscopic analysis of halothane bind?ing to plasma membrane Ca2+-ATPase[J].Biophys J，1998，74（2 Pt 1）：974-980.

[14] Pflugmacher D，Sandermann H J.The lipid/protein interface as a target site for general anesthetics：a multiple-site kinetic analysis of synaptosomal Ca2 +-ATPase[J] . Biochem Biophys Acta，1998，1415（1）：174-180.

Effect of Ketamineon theactivity of Atpasein Rats hippocampal Neurons

ZHOU Tong，CAO Xin-fang，CHEN Xi，CHEN Rui，LIU Mo，ZHANG Yu，WEI Cheng-wei，WU Yue，YU Dong-xu，LIU Zi-rui，JIANG Ren-li，LI Xin-ran，WANG Guan-ying，XIAO Jian-hua，GAO Li （College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract：In this study，we investigated the mechanisms of ketamine anesthesia on the central nervous system by examing the effect of different concentrations of ketamine on the activity of Atpase in Rats hippocampal Neurons.Fetal rat neurons from 16～18 days of pregnancy fetal rats were incubated at day 15 in culture with three different concentrations of ketamine，and adenosinetri?phosphatase assay kit was used to detect the activity of ATPase in the Fetal rat hippocampal.Our results showed that ketamine con?centration-dependently suppressed the activity of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase.These data indicate that central anes?thetic effect of ketamine may be related to the reduction in the activity of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase.

Key words：Ketamine；Anesthesia；Na+-K+-ATPase；Ca2+-Mg2+-ATPase

中圖分類號：S857.144

文獻標志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0010-04

收稿日期：2015-04-16

基金項目：國家自然科學基金（31372491）；黑龍江省自然科學基金（C201113）；黑龍江省教育廳基金（12531016）

作者簡介：周彤（1990-），女，碩士生，從事臨床獸醫學研究，E-mail：zhoutong1254@163.com

通訊作者:高利，E-mail：gaoli43450@163.com

Corresponding author：GAO Li