橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用機(jī)制探討

牛玉忠，韓玲軍

橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用機(jī)制探討

牛玉忠1，韓玲軍2

1.國(guó)藥控股山西有限公司(太原 030001)；2.太原師范學(xué)院

摘要：目的研究橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的舒張作用，并探討其機(jī)制。方法大鼠處死后，在解剖顯微鏡下分離其腎動(dòng)脈血管三級(jí)分支，剪成2 mm長(zhǎng)的血管環(huán)，通過(guò)微血管張力記錄儀記錄其張力，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄其電壓依賴性鉀電流。首先觀察橙皮素對(duì)靜息狀態(tài)下腎動(dòng)脈張力的影響。然后將腎動(dòng)脈血管環(huán)用60 mMKCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮達(dá)坪臺(tái)，加入橙皮素(10-6～10-4mol/L)對(duì)腎動(dòng)脈進(jìn)行濃度依賴性舒張，以預(yù)收縮的最大張力為100%，測(cè)定橙皮素對(duì)預(yù)收縮腎動(dòng)脈血管環(huán)的舒張百分比。用60 mMKCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈達(dá)坪臺(tái)后，預(yù)孵Kv通道抑制劑4-AP或KCa通道抑制劑TEA10 min，然后加入不同濃度梯度的橙皮素(10-6～10-4mol/L)舒張腎動(dòng)脈，觀察4-AP或TEA對(duì)橙皮素舒張腎動(dòng)脈的影響。采用兩步酶解法分離得到大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察并記錄橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的影響。結(jié)果橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的靜息張力沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。 橙皮素(10-6～10-4mol/L)可使預(yù)收縮的腎動(dòng)脈血管環(huán)發(fā)生濃度依賴性的舒張，最大舒張幅度分別為(53.39±5.27) %(KCl預(yù)收縮)和( 60.13±4.17 )%(PE預(yù)收縮)。預(yù)孵TEA沒(méi)有對(duì)橙皮素的舒張作用產(chǎn)生顯著影響，預(yù)孵4-AP使橙皮素的舒張幅度減小了14.26%(KCl預(yù)收縮)和18.31%(PE預(yù)收縮)。橙皮素(濃度選用舒張實(shí)驗(yàn)計(jì)算所得RC50)可使大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的電壓依賴性鉀電流I-V曲線發(fā)生非平行上移，最大電流密度增加了45.24%。結(jié)論橙皮素對(duì)KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮的大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)有濃度依賴性的舒張作用； 橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈的舒張作用與激活電壓依賴性鉀通道有關(guān)，與鈣激活鉀通道無(wú)關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎動(dòng)脈；舒張血管；橙皮素；鈣激活鉀通道；電壓依賴性鉀通道

橙皮素是一種黃酮類化合物，多存在于枳殼、陳皮、青皮等中藥材中。橙皮素具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、抗腫瘤、降脂、抗血小板聚集、舒張血管等[1-4]，這些作用表明橙皮素能夠?qū)π难芟到y(tǒng)的疾病起到一定的預(yù)防與治療作用。但橙皮素能否通過(guò)舒張腎動(dòng)脈而降低腎動(dòng)脈壓力卻未見(jiàn)報(bào)道。本課題觀察橙皮素對(duì)離體大鼠腎動(dòng)脈的舒張作用，并探討其機(jī)制，為橙皮素預(yù)防和治療腎動(dòng)脈高壓提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重230 g～250 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，將動(dòng)物飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥品橙皮素，PE，4-AP，TEA，木瓜蛋白酶，二硫丁四醇香，白蛋白，膠原蛋白F/H購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器DMT張力換能器，澳大利亞埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。Powerlab 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)，澳大利亞埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1離體大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的制備大鼠麻醉后，放血處理，取其腎臟，置于4 ℃100% 氧飽和的PSS液中(KCl 5.8，NaCl 144，MgCl24.2，CaCl22.5，HEPES 5，Glucose 11.1)。在解剖顯微鏡下找到并分離出大鼠腎動(dòng)脈的三級(jí)分支，剪成2 mm長(zhǎng)的血管環(huán)，利用兩根直徑40 μm的鋼絲懸掛于血管張力記錄儀。血管環(huán)制備、張力記錄及血管反應(yīng)性檢測(cè)的具體方法均參照文獻(xiàn)[5]。

首先用60 mmol/L連續(xù)刺激血管3次，選取每次收縮幅度相差不超過(guò)10%且收縮張力大于2 mN的血管環(huán)用于正式實(shí)驗(yàn)。在靜息狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入濃度梯度的橙皮素或等滲透壓的生理鹽水作為空白對(duì)照，觀察腎動(dòng)脈血管環(huán)肌張力的變化。用60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈血管環(huán)達(dá)坪臺(tái)，然后向浴槽內(nèi)累計(jì)加入濃度梯度的橙皮素或等滲透壓的生理鹽水作為空白對(duì)照，當(dāng)前一濃度舒張達(dá)坪臺(tái)時(shí)再加入下一濃度，觀察腎動(dòng)脈血管環(huán)肌張力的變化。以60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE收縮腎動(dòng)脈所達(dá)到的最大張力為100%，計(jì)算每一個(gè)濃度橙皮素或生理鹽水所致腎動(dòng)脈張力的百分比。

用60 mM KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈血

管環(huán)達(dá)坪臺(tái)，向浴槽內(nèi)加入電壓依賴性鉀通道阻斷劑4-AP或大電導(dǎo)鈣激活鉀通道阻斷劑TEA，孵浴10 min后，累積加入濃度梯度的橙皮素或等滲透壓的生理鹽水，以60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE收縮腎動(dòng)脈所達(dá)到的最大張力為100%，計(jì)算每一個(gè)濃度橙皮素或生理鹽水所致腎動(dòng)脈張力的百分比。

1.2.2橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鉀電流的影響參照文獻(xiàn)[6]，用兩步酶解法分離得到大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞：第一步酶解液為含有 0.5 mg/mL木瓜蛋白酶，0.5 mg/mL二硫丁四醇，0.5 mg/mL 白蛋白的無(wú)鈣PSS液；第二步酶解液為：含0.5 mg/mL膠原蛋白F，0.5 mg/mL 膠原蛋白H和5 mg/mL白蛋白的無(wú)鈣 PSS 液。

1.2.3腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鈣電流記錄鉗制電壓為-60 mV，以10 mV為步階，從-60 mV開(kāi)始，逐漸刺激到+60 mV，刺激時(shí)長(zhǎng)為500 ms。首先記錄空白情況下的大鼠腎動(dòng)脈Kv電流，然后記錄加入橙皮素后的Kv電流，橙皮素所用濃度為前面舒張實(shí)驗(yàn)時(shí)計(jì)算所得的RC50值。

2結(jié)果

2.1橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)靜息肌張力的影響在靜息狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入不同濃度的橙皮素和空白對(duì)照的生理鹽溶液，均沒(méi)有對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管環(huán)的靜息肌張力產(chǎn)生顯著影響。

2.2橙皮素對(duì)60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈血管環(huán)的最大收縮幅度分別為(3.45±1.28)mN和(4.02±1.36 )mN。

橙皮素可濃度依賴性的舒張60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮的腎動(dòng)脈血管環(huán)，最大舒張幅度分別為(53.39±5.27)%和(60.13±4.17)%。

提前預(yù)孵大電導(dǎo)鈣激活鉀通道阻斷劑TEA(10-3mol/L)沒(méi)有對(duì)橙皮素的舒張幅度產(chǎn)生顯著影響；提前預(yù)孵電壓依賴性鉀通道阻斷劑4-AP(10-4mol/L)，使橙皮素對(duì)60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈血管環(huán)的舒張幅度分別減弱了14.26%和18.31%。詳見(jiàn)圖1。

注：*P<0.05，**P<0.01 vs橙皮素。

圖1橙皮素(10-6～10-4mol/L)對(duì)60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮大鼠腎動(dòng)脈環(huán)的舒張作用

2.3橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鉀電流(Kv)的影響大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞Kv電流，在-40 mV開(kāi)始激活，刺激電壓為+60 mV時(shí)的電流密度為(32.54±6.02)pA/pF。橙皮素可使大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞Kv電流的I-V曲線非平行上移，在刺激電壓為+60 mV時(shí)的電流密度為(47.26±5.37)pA/pF。詳見(jiàn)圖2。

圖2　橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鉀電流影響

3討論

橙皮素是天然存在的一類黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物中，具有多種生物藥理學(xué)活性。在心血管系統(tǒng)，橙皮素能夠降低血壓，舒張大鼠冠狀動(dòng)脈等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈的靜息張力沒(méi)有顯著影響，能夠濃度依賴性降低60 mmol/L KCl或10-5mol/L PE預(yù)收縮大鼠的腎動(dòng)脈張力，最大舒張百分比分別為(53.39±5.27)%和(60.13±4.17)%。

鉀通道是鉀離子選擇性跨膜通過(guò)的離子通道，鉀通道在調(diào)節(jié)平滑肌舒縮活性中起重要作用。血管平滑肌上主要存在四種類型的鉀通道：Kv、KCa、KIR和KATP。激活鉀通道引起細(xì)胞膜超極化，引起血管舒張；抑制鉀通道可導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，引起血管收縮。

本實(shí)驗(yàn)觀察大電導(dǎo)鈣激活鉀通道TEA和電壓依賴性鉀通道阻斷劑4-AP對(duì)橙皮素舒張大鼠腎動(dòng)脈的影響。結(jié)果顯示，提前預(yù)孵TEA沒(méi)有對(duì)橙皮素的舒張幅度產(chǎn)生顯著影響；提前預(yù)孵4-AP，使橙皮素對(duì)KCl或PE預(yù)收縮腎動(dòng)脈血管環(huán)的舒張幅度分別減弱了14.26%和18.31%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證橙皮素舒張大鼠腎動(dòng)脈的作用與電壓依賴性鉀通道的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)觀察橙皮素對(duì)大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鉀通道電流的影響，結(jié)果顯示橙皮素可使大鼠腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞Kv電流的I-V曲線發(fā)生非平行上移。

本研究為臨床開(kāi)發(fā)使用橙皮素奠定了理論基礎(chǔ)，為橙皮素治療腎動(dòng)脈高壓提供了依據(jù)。

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[6]秦小江，侯曉敏.葛根素對(duì)大鼠離體冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用及其機(jī)制研究 [J].中國(guó)藥物與臨床，2014，1： 36-37.

(本文編輯王雅潔)

通訊作者：韓玲軍，E-mail：641292465@qq.com

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.10.013

文章編號(hào)：1672-1349(2016)10-1097-03

(收稿日期：2015-04-16)