轉化黃體酮菌株的篩選及轉化產物研究*

羅莎莎，李衛天，蔣　丹，蘇志偉，黃守瑞，冷　瀟△

1.成都醫學院 科研實驗中心(成都　610083)；2.宜賓學院 生命科學與食品工程學院(宜賓　644000)

轉化黃體酮菌株的篩選及轉化產物研究*

羅莎莎1，李衛天2，蔣丹1，蘇志偉1，黃守瑞1，冷瀟1△

1.成都醫學院 科研實驗中心(成都610083)；2.宜賓學院 生命科學與食品工程學院(宜賓644000)

【摘要】目的用微生物轉化的方法獲得新型的黃體酮類衍生物，對于相關新藥的研發至關重要。方法通過微生物轉化，利用薄層層析法(TLC)和硫酸顯色法跟蹤監測，篩選能夠有效轉化黃體酮的菌株，然后通過硅膠柱層析法對發酵液中的轉化產物進行分離純化，將純化產物進行質譜、紅外光譜和核磁共振譜表征，確定轉化產物的物質結構。結果本研究篩選到了1株真菌，通過分子生物學鑒定其為Fusarium屬，該菌能夠完全轉化底物黃體酮，同時得到2種重要的藥物中間體：雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內酯。結論本研究篩選得到的這株菌對大規模發酵生產雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內酯具有潛在的應用價值。

【關鍵詞】黃體酮；睪內酯；雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮；薄層層析法

黃體酮(progesterone)，全稱4- 孕甾烯 -3,20- 二酮，又稱孕酮、孕烯二酮、助孕素等，是一種臨床常用孕激素類藥物。用生物轉化方法獲得黃體酮類衍生物是生產甾體藥物中間體的重要方法[1]。1952年，Murray和Peterson用黑根霉對黃體酮進行轉化，得到了11α-羥基黃體酮，大大縮短了合成皮質酮的步驟，解決了生產可的松等皮質類藥物的原料來源這一最大難題[2]。目前，對黃體酮類衍生物的研究主要集中在C-11位和C-16位羥基化方向，而該化合物其他反應類型在國內外很少報道[3]，為此，本研究利用微生物對黃體酮進行生物轉化，以期獲得具有重要活性的新型衍生物。

1材料與方法

1.1菌株

本研究所用菌株為從成都動物園土壤中分離并保存的真菌菌株。

1.2培養基

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL、自然pH；轉化培養基：葡萄糖25 g、黃豆粉10 g、酵母膏10 g、氯化鈉5 g、磷酸氫二鉀5 g、水1 000 mL、pH5.5。

1.3黃體酮轉化菌株篩選

挑選本實驗室保存的50株有甾體轉化能力的真菌，于PDA培養基28～30 ℃活化5 d，制備孢子懸液。用10 mL無水乙醇溶解0.5 g 黃體酮，制成底物溶液。孢子懸液按5%的量接種發酵液，28 ℃，200 r/min，空氣搖床震蕩培養1 d， 加入0.5 g/L黃體酮底物溶液，28 ℃，200 r/min，震蕩培養轉化2 d。 投放底物溶液后，每隔12 h取1 mL發酵液，加入等體積三氯甲烷進行萃取，薄層層析法(TLC)分析轉化產物，展開劑為(乙酸乙酯∶三氯甲烷=8∶1，v/v)，然后噴灑顯色劑(硫酸∶甲醇=1∶10,v/v)，105 ℃干燥箱中，加熱3 min后，進行觀察。

1.4菌株分子生物學鑒定

采用CTAB法，提取菌株的總DNA為模板，進行PCR擴增[4]，擴增采用的是1對真菌通用引物[5]，其中，上游引物的序列為：5′-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3′，下游引物的序列為：5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′。 PCR反應體系為50 μL： 基因組DNA 4 μL，上下游引物各1 μL， 2.5 mM dNTP mix 5μL，10×PCR 緩沖液5 μL， Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 33.5 μL。PCR擴增程序：1)94 ℃預變性5 min；2)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；3)72 ℃延伸7 min。用DL2000 DNA Marker作分子量標記， 1.5%瓊脂糖電泳90 v進行40 min，同時，將擴增產物委托華大基因測序。

1.5黃體酮轉化產物的分離純化

投放底物溶液轉化2 d后，取出發酵液，等體積三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用旋轉蒸發儀旋干，得到晶體。用硅膠柱層析法純化轉化產物，濕法上柱，將晶體用少量洗脫液溶解后上樣，控制流速為1 mL/min，部分收集器收集洗脫液，TLC法分析洗脫液，把Rf值相同的物質合并，用旋轉蒸發儀旋干，溶解后再進行點樣，進行硫酸顯色檢測，確保產物純度。

1.6生物轉化產物的結構鑒定

將純化產物進行質譜(TOF-MS)、紅外光譜(IR)和核磁共振譜(NMR)表征，同時，結合文獻[6]和實驗室之前純化得到的黃體酮類衍生物光譜數據進行分析，確定轉化產物物質結構。

2結果

2.1黃體酮轉化菌株的篩選

實驗室保存的50株真菌均為霉菌，初篩發現都能夠在以甾體類物質為唯一碳源的培養基上生長，所以，可能存在能有效轉化黃體酮的菌株。通過以黃體酮為底物進行生物轉化，TLC法和硫酸顯色法檢測轉化情況，篩選到有8株菌對黃體酮有轉化能力。

檢測結果表明，菌株1-2轉化能力最強，轉化2 d后， 黃體酮完全降解，生成2種轉化產物，產量較高，便于后期純化，同時，其中1個產物的Rf值不同于實驗室之前獲得的轉化產物，可能是結構比較新穎的衍生物。因此，本研究選擇1-2這株菌進行研究(圖1)。

圖1TLC法分析菌株1-2轉化黃體酮

注：1、黃體酮標品；2、菌株1-2轉化黃體酮情況

2.2菌株分子生物學鑒定

根據1.4的方法，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增序列，同時，委托華大基因進行測序，發現該序列大小為542 bp，與預期大小相符(圖2)。其核苷酸序列如下：

TTCCTCTCGCCTTATTGATATGCTTAAGTT CAGCGGGTATTCCTACCTGATTCGAGGTCA ACTTCAGAAGAGTTGGGGGTTTTACGGCGT GGCCGCGCCGCTCTCCAGTCGCGAGGTGTTA GCTACTACGCGATGGAAGCTGCGGCGGGAC CGCCACTGTATTTGGGGGACGGCGTGTGCCC ACGGAGGGCCTCCGCCGATCCCCAACGCCAG GCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCT CGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCG GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGAT TCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAG AGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAA TTTATTTGCTTGTTTTACTCAGAAGAAACA TTATAGAAACAGAGTTAGGGGGTCCTCTGG CGGGGGCGGCCCGTTTTCACGGGGCCGTCTG TTCCCGCCGAGGCAACGTTTAGGTATGTCA CAGGGTGATGAGTGTTAGTCCGTCCCA

通過將該序列在Genbank數據庫中進行BLAST同源序列比對，發現該菌與Nectriahaematococca(Fusariumsolani的有性型)同源性為100%，因此，初步確定該菌為Fusarium屬，故命名為Fusariumsp.1-2。

2.3轉化產物分離及鑒定

通過TLC法和硫酸顯色法進行定時跟蹤檢測，初步了解到該菌以黃體酮做底物的生物轉化過程(圖3)。轉化1 d時，產物 P-1出現，2 d時，P-1達到最大量，轉化率為72%， 同時產物P-2出現，轉化率為28%，此時黃體酮徹底降解。

圖2菌株1-2 PCR產物電泳檢測結果

注：1、菌株1-2 PCR產物；2、DL2000 DNA Marker

圖3黃體酮生物轉化過程

將純化產物進行TOF-MS、IR和NMR表征，得到表征數據如下：

P-1，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(androst-1,4-dien-3,17-dione) mp 139～141 ℃;IR vmax (cm-1) 1 740, 1 656, 1 621, 1 601; TOF-MS m/z 285 [M+H]+,307 [M+Na]+,323 [M+K]+,591 [2M+Na]+;1H NMR (CDCl3) δ (ppm) 7.04 (1H,d,J = 10 Hz,H-1),6.24 (1H,dd,J = 10.2,1.9 Hz,H-2),6.09 (1H,s,H-4),0.95 (3H,s,H-18), 1.25 (3H,s,H-19)。

P-2，17同質-氧雜-雄甾-1，4二烯-3，17二酮(17-oxa-homo-androst-1,4-diene-3,17-dione)；TOF-MS m/z 301.176 1 [M+H]+,323.162 3 [M+Na]+,339.136 4 [M+K]+;1H NMR (CDCl3) δ(ppm) 7.04 (1H,d,H-1),6.25 (1H,dd,H-2),6.09 (1H,s,H-4),1.22 (3H,s,H-19),1.39 (3H,s,H-18)。

代謝產物P-1的質譜表明其分子量為284，結合碳譜(表1)確定其化學結構式為C19H24O2，且其1HNMR、13CNMR和IR數據與相關文獻[6]報道完全一致。因此，確定產物P-1為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。

代謝產物P-2的質譜表明其分子量為300，結合碳譜(表1)，確定其化學結構式為C19H24O3，且其1HNMR、13CNMR和IR數據與相關文獻[6]報道完全一致，因此，確定化合物P-2為睪內酯。

表1　黃體酮及轉化產物NMR譜值

3討論

黃體酮生物轉化的研究過去主要集中在C-11位和C-16位等羥基化方向[7]，Fusarium菌屬轉化黃體酮生成睪內酯的相關報道很少。TLC法和硫酸顯色法跟蹤檢測結果表明，用菌株Fusariumsp.1-2轉化黃體酮，轉化1 d，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮生成，轉化2 d，黃體酮完全降解，同時發酵液中生成睪內酯，根據轉化產物的生成順序，推測通過Fusariumsp.1-2的生物轉化酶系，黃體酮側鏈被降解，生成雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，并在C-17位生成酮基，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮再在C-17位的酮基旁引入氧，形成內酯，該反應為典型的Baeyer-Villiger反應[8]。目前，霉菌中僅見到青霉屬菌對去氫表雄酮、孕烯醇酮和雄烯二酮進行類似的反應[9]。

用Fusariumsp.1-2轉化黃體酮，雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內酯2種轉化產物的轉化率分別約為72%和28%，產物產量較高，沒有檢測到副產物，便于后期純化。雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內酯是重要的甾體藥物中間體，利用雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮能合成一些非常重要的激素類藥物，如口服避孕藥、蛋白同化激素和一些性激素[10]；睪內酯作為芳香酶抑制劑，對于治療女性乳腺癌具有一定療效。因此，該菌對于甾體激素類藥物的生產具有較強的應用潛力，有關利用該菌發酵生產雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和睪內酯的發酵條件的優化還在進一步研究中。

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Screening of Progesterone-transforming Strains and the Reaserch on Its Transformation Products

LuoShasha1,LiWeitian2,JiangDan1,SuZhiwei1,HuangShourui1,LengXiao1△.

1.CenterforScientificReseach,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,YibinCollege,Yibin644000,China

【Abstract】ObjectiveThe new progesterone derivatives obtained with the microbial transformation method are vital for the research and development of new drugs. MethodsTLC and Sulfuric acid methods were adopted to screen the strains which are capable of transforming progesterone with the help of microbial transformation. The silica gel column chromatography was used to purify the products in the fermented liquid, and mass spectrum, infrared spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum were employed to identify the structure of the purified products. ResultsA strain which could transform progesterone completely was screened and identified as Fusarium of Molecular biology identification. Two important intermediates of hormone drugs in the purified transformation products were aquired and identified as Androst-1,4-dien-3,17-dione and testolactone. ConclusionThe screened strain is of potential value in producing the two important intermediates of hormone drugs including Androst-1,4-dien-3,17-dione and testolactone in a lager scale.

【Key words】Progesterone; Testolactone; Androst-1,4-dien-3,17-dione; Thin layer chromatography

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.02.006

基金項目：＊國家大學生創新項目(No:201513705041 )

通信作者：△冷瀟，E-mail:417470951@qq.com

【中圖分類號】Q939.9

【文獻標志碼】A

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160406.1555.028.html

·論著·