不同牛場致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

謝海鵬　郭 召　（山東省諸城市畜牧獸醫管理局　262200）

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不同牛場致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

謝海鵬郭 召（山東省諸城市畜牧獸醫管理局262200）

摘要為了解不同牛場犢牛腹瀉的發病原因及致病性大腸桿菌的耐藥情況。分別采取山東諸城市某牛場、山東五蓮縣某牛場和山東膠州市某牛場腹瀉或肺、腸黏膜等病死犢牛的病料，進行細菌的分離培養、生化分析及藥敏試驗。結果表明，犢牛腹瀉是由致病性埃希氏大腸桿菌引起，不同牛場的大腸桿菌菌株對同樣的抗生素有不同程度的耐藥性。結論：引起3個牛場犢牛腹瀉及致犢牛死亡的病原均為大腸桿菌，分離菌株對抗生素有不同程度的耐藥性。

關鍵詞犢牛腹瀉大腸桿菌分離培養生化試驗藥敏試驗

大腸桿菌于1885年首先由Escherich從嬰兒糞便中分離到，其后，國內外不少學者報道了本病，并確定了大腸桿菌在引起仔豬下痢中有首要意義［1］。犢牛腹瀉大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的主要以犢牛腹瀉和敗血癥為主的一種細菌性疾病，是犢牛的一種常見疫病［2］，多發生于出生后1～2周內的新生犢牛，在我國的各個省份和世界各地的養牛區均有發生。近幾年來，隨著養牛業規模的不斷擴大，犢牛腹瀉的病例呈上升趨勢，嚴重影響著犢牛的生長發育和成年后的生產性能，造成了養牛業不容忽視的經濟損失［3］。為探討各地區犢牛腹瀉的病因，筆者對安徽、黑龍江和山東部分集約化奶牛場腹瀉病死犢牛及嚴重腹瀉犢牛進行病原分離鑒定，并進行藥敏試驗，對有效的預防該病及研究該病的發展變化趨勢具有一定的指導意義。

1　材料

1.1病料分別在3個牛場（山東諸城市某牛場、山東五蓮縣某牛場和山東膠州市某牛場）無菌采取病死犢牛病料（肺、腸等）。

1.2培養基腦心浸液培養基（BHI）、普通肉湯培養基均由市售商品。

1.3試劑葡萄糖，麥芽糖，V-P試劑，H2S，枸櫞酸鹽等生化試劑購于杭州天和微生物試劑有限公司。Ex Tap DNA聚合酶，10×Buffer，DNTP、DL Marker2000和溴化已錠（EB）均購于北京全式金生物技術有限公司。細菌DNA提取試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.4主要儀器電熱恒溫培養箱DRP-9162型（上海森信實驗儀器有限公司）、顯微鏡（NIKON公司）、恒溫搖床TH2-300（上海一恒科學儀器有限公）、潔凈工作臺SW-CJ-2FD型（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、梯度PCR儀S1000（北京金業德祥科技有限公司）、BG-Power600i型電泳儀（西安超杰生物科技有限公司）。

1.5藥敏紙片氨芐西林（AM，10μg，批號KL15）、青霉素（P，10μg，批號KL21）、四環素（TC，30μg，批號KL20）、慶大霉素（GM，10μg，批號KL15）、卡那霉素（K，30μg，批號KK28）、氯霉素（C，30μg，批號KJ20）、利福平（RA，5μg，批號KJ17）、環丙沙星（CIP，5μg，批號KL29）。購于溫州市康泰生物科技有限公司。

2　方法

2.1細菌分離培養在超凈工作臺下無菌挑取腸黏膜病變部位，直接劃線接種于普通肉湯瓊脂平板，置于37℃恒溫培養箱內培養18～24h，觀察結果［4］。在普通瓊脂平板上挑取表面光滑、濕潤、半透明的中等大小的菌落，接種于腦心浸液培養基中，放入恒溫搖床內震蕩8～10h，吸取10ul的菌液分別進行涂片，再革蘭氏染色，鏡檢，觀察細菌的形態［5］。

2.2生化試驗用已滅菌的接種環蘸取少量的細菌純培養液分別接于生化微量管：葡萄糖、麥芽糖、棉子糖、蔗糖、H2S、M-P、V-P和枸櫞酸鹽。置于37℃培養箱內培24h觀察結果［6］。

2.3PCR鑒定（1）引物的設計與合成：根據GenBank中大腸桿菌16sRNA基因序列設計擴增引物，F（上游引物）：5’-GAGTGGCGGACGGGTGAGTA-3’；R（下游引物）：5’-GGCTGCTGGCACGGAGTTAG-3’，目的片段427bp，上述引物委托哈爾濱博仕生物有限公司合成。（2）細菌DNA的提取：按照細菌DNA提取試劑盒的使用說明來提取即可，-20℃保存。（3）PCR擴增：以提取的細菌DNA為模板，PCR反應體系50μl：DNA模板2μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNTP 2.5μl，10×Buffer 5μl，Tap酶1μl，ddH2O 37.5μl；PCR反應條件：95℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環。72℃延伸10min，12℃終止反應。（4）DNA瓊脂糖凝膠電泳：取10μl的PCR擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，120V，15min。以DNA Marker DL2000為標準分子量，在紫外燈下觀察電泳結果并照相。

2.4藥敏試驗應用WHO推薦的改良藥敏紙片擴散法（K-B法），按照NCCLS上的標準來做：先將純培養的菌液計數，然后稀釋到1～1.5×108cfu/ml。取100μl滴于普通肉湯瓊脂平板中，用已滅好的涂布棒涂勻，再用滅菌尖頭鑷子將藥敏片平鋪在肉湯瓊脂平板上，并且輕輕的壓緊，每個平板上貼5個藥敏片，藥敏片一旦接觸平板，就不能在移動。最后將貼紙片的平板底部在下，在37℃恒溫培養18～24h，分析結果［3］。

3　試驗結果

3.1細菌的培養特性3個牛場的分離菌株（山東諸城市某牛場菌株命名為H1-3、山東五蓮縣某牛場菌株命名為C2、山東膠州市某牛場菌株命名為1.2）在普通瓊脂平板上生長均呈呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的圓形菌落。

圖1　分離菌株在普通瓊脂平板上的菌落形態

3.2染色、鏡檢結果菌株H1-3、C2和1.2分別取15μL純培養菌液，涂片，經革蘭氏染色后，鏡檢可觀察到Gˉ無芽孢、散在的桿菌。

圖2　H1-3菌株的鏡檢結果　圖3　C2菌株的鏡檢結果　圖4　1.2菌株的鏡檢結果

3.3生化試驗結果在恒溫培養箱內取出已接菌的生化微量鑒定管，根據顏色的變化，按照生化試驗結果判定標準來判斷（有的需要指示劑來進一步的判定）。

表1　分離菌株生化試驗結果

3.4PCR鑒定結果取PCR擴增產物5～8μl，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，120V，15min。H1-3、C2和1.2菌株在427bp處均擴增出目的片段，與預計的片段吻合。

圖5　PCR鑒定結果

3.5藥敏試驗結果抑菌環的大小與1994年12月版的《美國NCCLS藥敏試驗紙片擴散法法規》做對比來分析判定藥敏試驗結果：

表2　分離菌株藥敏試驗結果

4　討論

4.1大腸桿菌的鑒定本試驗在3個牛場（山東諸城市某牛場、山東五蓮縣某牛場和山東膠州市某牛場）中采取的病料，進行實驗室診斷。在普通肉湯瓊脂平板上的菌落形態與王雙山等［7］報道相符，呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的圓形菌落。生化試驗結果表明，C2菌株和1.2菌株生化結果相同，H1-3菌株的結果與C2和1.2菌株有所不同，但均與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中介紹相符，為了進一步對菌株的鑒定，利用大腸桿菌16sRNA基因序列設計引物進行鑒定，在目的片段427bp處均有明亮的條帶，試驗結果表明引起犢牛腹瀉的病原為大腸桿菌。

5　結論

從本試驗可以看出，引起3個牛場犢牛腹瀉或致犢牛病死的病原均為大腸桿菌。藥敏試驗結果表明：三株菌株均對青霉素和利福平有較強的耐藥性，其中H1-3菌株對環丙沙星、卡那霉素和四環素的敏感性很強，；C2菌株對慶大霉素和卡那霉素有較強的敏感性；1.2菌株對四環素、慶大霉素、卡那霉素和環丙沙星仍然有較強的耐藥性。可見，不同牛場分離出的大腸桿菌對同種抗生素有不同的耐藥性。4.2藥敏試驗藥敏試驗結果顯示，H1-3、C2和1.2菌株對青霉素和利福平有較強的耐藥性。其中1.2菌株對四環素、慶大霉素、卡那霉素和環丙沙星的耐藥性很強，但H1-3菌株對環丙沙星、卡那霉素和四環素有很強的敏感性，C2菌株對慶大霉素和卡那霉素也有很強的敏感性。王春分等［8］對大腸桿菌的藥敏試驗表明，對環丙沙星、慶大霉素較敏感，對青霉素、四環素有一定的耐藥性。范偉興等［9］對62株大腸桿菌分離菌進行藥敏試驗，結果表明，50%以上菌株對青霉素、四環素有較強的耐藥性，對慶大霉素有較高的敏感性。可見，不同地區的牛場分離出的大腸桿菌對相同的抗生素的敏感度不同，這主要是由于不同的牛場使用抗菌藥物的種類有關，同時也說明長時間使用單一抗生素或大量的使用抗生素是引起耐藥性的重要原因。因此，對大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗，選取敏感度高的抗生素用于治療，對治愈本病十分有效，對疾病的預防也有一定的意義。

參考文獻

［1］ 蘇丹萍， 趙彥宗， 陳敏鴻等. 廣東地區部分豬場大腸桿菌的分離鑒

定及藥敏試驗［J］. 畜牧與獸醫， 2010， 42（7）∶ 80-81.

［2］ 方光遠， 張姝， 樊婕等. 犢牛腹瀉大腸桿菌疫苗的研制與應用［J］.中國奶牛， 2008（8）∶ 36-38.

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［7］ 王雙山， 張敬禮， 劉定昌等. 肉雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］. 河南農業科學， 2003（6）∶ 43-44.

［8］ 王春分， 吳萍. 17種抗菌獸藥對豬雞大腸桿菌和金葡萄球菌的藥敏試驗研究［J］. 沈陽農業大學學報， 1999， 30（4）∶ 454-456.

［9］ 范偉興， 胡敬東， 肖傳發等. 雞大腸桿菌原特性的研究［J］. 中國家禽， 1996（5）∶ 31-32.

中圖分類號：S852.61+2

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733（2016）06-0006-03

收稿日期：（2016-03-11）