應用實時熒光定量PCR技術探討B群鏈球菌與胎膜早破的關系*1

楊坤祥，王芬芳，鐘澤艷

(惠州市第一婦幼保健院檢驗科，廣東惠州 516003)

·臨床研究·

應用實時熒光定量PCR技術探討B群鏈球菌與胎膜早破的關系*1

楊坤祥，王芬芳，鐘澤艷

(惠州市第一婦幼保健院檢驗科，廣東惠州 516003)

摘要:目的探討應用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測B群鏈球菌與胎膜早破之間的關系。方法將300例發生胎膜早破的孕婦設為研究組，300例未發生胎膜早破的孕婦設為對照組，采集孕婦宮頸分泌物，用實時熒光定量PCR法和細菌培養法檢測B群鏈球菌。結果對照組宮頸分泌物檢測B群鏈球菌陽性率為7.00%(21/300)；研究組宮頸分泌物檢測B群鏈球菌陽性率為20.00%(60/300)。實時熒光定量PCR法檢測B群鏈球菌陽性率為13.50%(81/600)；顯色細菌培養法檢測B群鏈球菌陽性率為10.00%(60/600)；傳統細菌培養法檢測B群鏈球菌陽性率6.67%(40/600)。結論圍生期孕婦生殖道B群鏈球菌感染與胎膜早破的關系密切，應加強孕晚期B群鏈球菌的篩查，降低發生胎膜早破的風險。實時熒光定量PCR技術檢測B群鏈球菌的陽性率明顯高于細菌培養法，且用時短，準確度高。盡早檢出B群鏈球菌感染有可能降低或預防胎膜早破的發生。

關鍵詞:聚合酶鏈反應；B群鏈球菌；胎膜早破

B群鏈球菌(GBS)學名為無乳鏈球菌，能引起牛乳房炎，嚴重危害畜牧業。現發現該菌也能感染人類，尤其是新生兒，可引起敗血癥、腦膜炎、肺炎等，病死率極高，并可產生神經系統后遺癥，被醫學界重視。GBS正常寄居于下呼吸道、泌尿生殖道和直腸，帶菌率達30%，健康人的鼻咽部也可分離到GBS。新生兒感染跟母體帶菌有密切關系，分娩時胎兒可經帶菌產道而被感染，也可由醫護人員呼吸道所帶病菌傳播引起[1]。國內文獻報道，圍生期孕婦GBS感染率為3.4%～19.01%，新生兒感染率1.40%～9.95%[2-5]。感染率的不同可能與國家地區、種族基因、年齡、教育程度、培養技術及培養頻率不同有關。本研究對300例未發生胎膜早破的孕婦(對照組)和300例發生胎膜早破的孕婦(研究組)采取3種篩查方式，研究GBS與胎膜早破之間的關系，旨在盡早篩查出圍產期孕婦的GBS感染情況，以期降低胎膜早破的發生率。現將具體過程及結果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料將2015年1～8月到本院住院分娩的600例孕婦設定為研究對象，將發生胎膜早破的300例孕婦設為研究組，未發生胎膜早破的產婦300例設為對照組。全部孕婦在自愿并完全了解檢測目的與研究目的的前提下參與本次研究。

1.2儀器和試劑美國ABI7500實時熒光定量PCR擴增儀；上海力申公司HF90/hf240 CO2培養箱；法國生物梅里埃VITEK2-compact分析儀；GBS核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)、陰陽性對照均由福建泰普生物科學有效公司提供；哥倫比亞血瓊脂平板由江門凱林有限公司提供；GBS顯色平板由鄭州安圖生物有限公司提供；馬尿酸鈉生化微量管由杭州天河微生物試劑公司提供；采用金黃色葡萄球菌(ATCC29523)作為質控標準菌種，來自衛生部臨檢中心。

1.3診斷標準胎膜早破的定義參照全國高等醫學院校教材《婦產科學》中有關診斷定義[6]。孕婦符合下列之一即可診斷為胎膜早破：(1)孕婦自覺有大量液體自陰道流出；(2)酸堿試紙測定陰道分泌物pH>7；(3)陰道液涂片烘干后鏡檢可見羊齒狀結晶；(4)陰道液沉渣涂片鏡檢可見毳毛。

1.4方法

1.4.1標本采集按照GBS核酸檢測試劑盒標本采集要求，孕婦取膀胱截石位，常規消毒外陰，滅菌窺陰器擴開陰道暴露宮頸，用棉球擦去宮頸口黏液，分別將3支無菌長棉簽分別插入宮頸口內1.5～2.0 cm，轉動1圈停留30 s后，取宮頸分泌物置無菌試管中立即送檢。將其中一支按以上方法采集的宮頸分泌物標本按臨床微生物學檢驗常規方法(以下稱為“傳統培養法”)接種于哥倫比亞血平板進行培養；另一只宮頸分泌物標本接種于B群鏈球菌顯色平板(以下簡稱為“顯色培養法”)進行培養，兩個平板都置于35 ℃，5% CO2培養箱，孵育24 h后觀察血平板上的菌落形態及β溶血現象和顯色平板的顯色情況，發現可疑菌落后進行觸酶試驗、CAMP試驗和馬尿酸鈉水解試驗，最后用VITEK2-compact分析儀確證鑒定。

1.4.2實時熒光定量PCR反應檢測將其中一支宮頸分泌物標本按試劑盒要求提取分泌物中細菌的DNA(以下簡稱為熒光PCR法)，上清液用于PCR擴增，在ABI7500 PCR擴增儀上按下列循環參數進行擴增反應：stage 1，37 ℃，2 min；stage 2，94 ℃，2 min；stage 3,94 ℃，15 s，55 ℃，45 s；共40個循環，在stage 3，55 ℃，45 s末端收集熒光，反應體積50 μL。

1.5統計學處理采用SPSS18.0統計學軟件包進行數據的統計分析，3種檢驗方法檢測結果分別按配對設計下兩組頻數分布的χ2檢驗進行比對，對照組和研究組GBS陽性發生率按完全隨即設計下兩組頻數分布的χ2檢驗進行比對。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.13種檢驗方法檢測GBS陽性率比較對照組和研究組共600例產婦中，熒光PCR法GBS陽性數81例，篩查陽性率為13.50%；顯色培養法GBS陽性數60例，篩查陽性率為10.00%；傳統培養法GBS陽性數40例，篩查陽性率為6.67%。3種檢驗方法檢測結果兩兩之間GBS陽性率比較采用Fisher精確檢驗，檢驗水準校正為0.017(α=0.05/3=0.017)。可以認為3種方法檢驗出GBS的陽性概率不相等，且熒光PCR法檢測GBS篩查陽性率高于顯色培養法和傳統培養法，且差異具有統計學意義(P<0.017)。見表1。

2.2對照組和研究組的B群鏈球菌檢測結果由于熒光PCR法的檢測陽性率和準確率都比顯色培養法和傳統培養法要高，所以選用熒光PCR法的檢測結果作為參考標準。對照組300例產婦中，GBS檢出21株，陽性率為7.00%；研究組300例產婦中，GBS檢出60株，陽性率為20.00%。故發生胎膜早破的產婦的GBS陽性率高于未發生胎膜早破的產婦，且差異具有統計學意義(χ2=27.708，P=0.000)。

表1　　3種GBS檢驗方法結果比較[n(%)]

3討論

本研究結果顯示，熒光PCR法檢測GBS的篩查陽性率(13.50%)高于細菌培養法(10.00%和6.67%)，檢測結果高于王麗等[7]報道的9.40%和5.80%。3種方法在GBS陽性檢出率上差異有統計學意義(P<0.017)，且熒光PCR法的陽性檢出率高于細菌培養法。另一方面，熒光PCR法用時短，平均7 h可以完成檢測，而細菌培養法要平均48 h才能完成檢測，可為盡早診斷提供依據，爭取寶貴的治療時間。

研究結果顯示，胎膜早破組宮頸分泌物GBS陽性檢出率為20.00%，未發生胎膜早破組宮頸分泌物GBS陽性檢出率為7.00%，本研究結果低于李小梅等[8]報道的29.59%和11.93%，也低于李曉英等[9]報道的為29.3%和11.7%，可能跟地區差異、試驗方法，采樣水平等有關。本研究中，發生胎膜早破的產婦的GBS陽性檢出率高于未發生胎膜早破的產婦，且差異具有統計學意義(P<0.05)，說明GBS在生殖道內過量繁殖是圍產期孕婦發生胎膜早破的誘因之一，GBS與胎膜早破的關系十分密切，完整的胎膜對病原體的入侵具有屏障作用，若胎膜受到感染，往往會導致胎膜早破。在感染的眾多病原體中，由于GBS對絨毛膜的吸附和穿透能力最強，所以危害也最大。寄居在宮頸、陰道、直腸和尿道等處的GBS可上行至胎膜，從而使胎膜感染，并可以通過炎性細胞的吞噬作用和細菌產生的蛋白水解酶的直接入侵，使胎膜局部張力降低，從而導致胎膜早破[10-12]。

近年來，世界各地學者對GBS進行大量研究，多數學者認為GBS與圍生期感染有關，在孕晚期對所有孕婦進行篩查非常必要。實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、準確性好、用時短等特點，適合在醫院進行GBS的篩查，特別是對于已發生胎膜早破的孕婦，應盡早完成檢測，及時進行預防性治療。

參考文獻

[1]李凡，徐志凱．醫學微生物學[M]．8版．北京：人民衛生出版社，2013．

[2]吳海軍，呂磊，宋柳安，等．B群鏈球菌在孕婦及新生兒中的帶菌調查及耐藥性研究[J]．重慶醫科大學學報，2013，38(10)：1234-1236．

[3]時春艷，曲首輝，楊磊，等．妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測及帶菌對妊娠結局的影響[J]．中華婦產科雜志，2010，45(1)：12-16．

[4]應群華，嚴文衛，丁金龍．圍產期生殖道菌群檢測和B群鏈球菌篩查[J]．中國微生態學雜志，2006，18(6)：491-492．

[5]馬延敏，吳連方，黃醒華，等．孕婦B組溶血性鏈球菌帶菌與母嬰預后的探討[J]．北京醫學，2005，27(9)：516-518．

[6]樂杰．婦產科學[M]．7版．北京：人民衛生出版社，2008：137．

[7]王麗，葉巍，馬杰．實時熒光 PCR 技術和細菌培養法檢測妊娠晚期孕婦定植B 群鏈球菌臨床分析[J]．國際檢驗醫學雜志，2014，35(16)：2220-2221．

[8]李小梅，李瑾，袁敏智．用聚合酶鏈反應技術探討B群鏈球菌與胎膜早破的關系[J]．河北醫學，2011，17(3)：300-302．

[9]李曉英，段純．生殖道B群鏈球菌感染與胎膜早破的關系及預防[J]．現代護理，2005，11(12)：944-945．

[10]朱敏，范建霞，程利南．圍產期B族鏈球菌感染的研究進展[J]．中華婦產科雜志，2005，40(2)：137-141．

[11]段濤．B族溶血性鏈球菌感染與妊娠[J]．中國實用婦科與產科雜志，2003，19(12)：705-706．

[12]蘇良香，裴美蘭，張建平，等．B族溶血性鏈球菌感染與胎膜早破及早產的關系[J]．檢驗醫學，2007，22(6)：728-729．

△通訊作者,E-mail：haoxkg@fmmu.edu.cn。

*基金項目：惠州市科技計劃項目(20150806)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.035

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1387-02

(收稿日期：2016-01-09)