八正顆粒的質量標準提高研究

史亞柱，劉皈陽，李　翔，黎春彤，馮春景

1.解放軍第203醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.解放軍總醫院第一附屬醫院，北京 100048

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·藥學研究·

八正顆粒的質量標準提高研究

史亞柱1，劉皈陽2*，李翔2，黎春彤2，馮春景2

1.解放軍第203醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.解放軍總醫院第一附屬醫院，北京 100048

[摘要]目的建立八正顆粒的質量標準。方法采用薄層色譜法對八正顆粒中的大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草進行定性鑒別；采用HPLC法對制劑中的梔子進行含量測定。結果大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草的薄層色譜斑點清晰，重現性好，專屬性強，陰性對照無干擾。含量測定中，梔子苷在2.32～46.4 μg/mL范圍內線性關系良好(r=0.999 9)，平均回收率為99.41%，RSD=1.46% (n=6)。結論所建立的定性、定量方法簡便易行，重現性好，為八正顆粒提供了有效的質量控制方法。

[關鍵詞]八正顆粒；質量標準；薄層鑒別；高效液相色譜法

0引言

八正顆粒是解放軍第二〇三醫院的醫院制劑，由八正合劑演變而來，由瞿麥、木通、大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草、萹蓄、滑石共9味藥材組成，清熱瀉火、利水通淋[1]。常用于膀胱炎、尿道炎、急性前列腺炎、泌尿道結石及急性腎炎、急性腎盂腎炎。在臨床中長期使用，療效確切，獲得患者的廣泛認可[2]。八正顆粒并未收入藥典，有文獻對其薄層鑒別、含量測定進行報道，但對其質量控制尚無統一標準[3-5]。為提高產品質量標準，保證藥效一致，本研究采用薄層色譜分別對八正顆粒中的大黃、梔子、車前子、燈心草、甘草進行定性鑒別，采用HPLC法測定制劑中梔子苷的含量，對八正顆粒進行全面的質量標準研究，建立和完善八正顆粒質量標準，為控制藥品質量、保證藥品安全有效提供依據。

1儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀，Agilent 1200系列四元泵，VWD檢測器，自動進樣器，ChemStation化學工作站(美國安捷倫公司)；瑞士卡瑪Linomat 5半自動點樣儀；梅特勒-托利多AE200電子天平；80-2離心沉淀機(金壇市金南儀器廠)；ZF-90暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)；KQ3200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

德國默克硅膠60高效薄層板(德國Merck)；對照藥材、對照品均購自中國食品藥品檢定研究院：梔子苷對照品(批號：110749-201316)、大黃素對照品(批號：110756-200110)、大黃酚對照品(批號：110796-201308)、蘆薈大黃素對照品(批號：110795-201308)、大黃素甲醚對照品(批號：758-9803)、甘草苷對照品(批號：111610-201106)、毛蕊花糖苷對照品(批號：111530-201411)為含量測定用；大黃對照藥材(批號：121249-201304)、梔子對照藥材(批號：120986-201309)、車前子對照藥材(批號：121628-201001)、燈心草對照藥材(批號：121463-201002)、川木通對照藥材(批號：121409-201402)、瞿麥對照藥材(批號：121685-201301)、萹蓄對照藥材(批號：121673-201201)、甘草對照藥材(批號：120904-201318)為薄層鑒別用。

2方法與結果

2.1薄層鑒別

2.1.1大黃的薄層色譜鑒別取本品2 g，加二氯甲烷20 mL，超聲處理30 min，濾過蒸干，1 mL甲醇復溶為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.2 g，參照2015版《中國藥典》[1](以下統稱《藥典》)大黃藥材薄層鑒別項下方法處理。再取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。上述溶液按照《藥典》大黃藥材薄層鑒別項下色譜條件展開并觀察，結果見圖1。

圖1　大黃的TLC圖譜

4.大黃對照藥材，5.蘆薈大黃素對照品，6.大黃素對照品，7.大黃素甲醚對照品，8.大黃酚對照品，9.缺大黃陰性樣品；a.365 nm下觀察，b.置氨蒸氣中熏后，條斑變為紅色結果

2.1.2梔子的薄層色譜鑒別取本品2 g、梔子對照藥材0.2 g，參照《藥典》梔子藥材薄層鑒別項下方法，以甲醇超聲法制備供試品和對照藥材溶液。再取梔子苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。上述溶液以二氯甲烷-甲醇(5∶1)展開并觀察，在10%硫酸乙醇溶液中，105 ℃加熱顯色，結果見圖2。

2.1.3車前子的薄層色譜鑒別取“2.1.2”項下供試品溶液。另取車前子對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。再取毛蕊花糖苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。上述溶液分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-醋酸-水(2∶1∶7)展開并觀察，置紫外光燈(365 nm)下檢視，結果見圖3。

2.1.4甘草的薄層色譜鑒別取“2.1.2”項下供試品溶液。另取甘草對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。上述溶液分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(7∶0.5∶1)展開，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱顯色，見圖4。

圖2　梔子TLC圖譜

4.梔子對照藥材，5.梔子苷對照品，6.缺梔子陰性樣品

圖3　車前子TLC圖譜

4.車前子對照藥材，5.毛蕊花糖苷對照品，6.缺車前子陰性樣品

圖4　甘草TLC圖譜

4.甘草對照藥材，5.甘草苷對照品，6.缺甘草陰性樣品；b.365 nm下檢視

2.1.5燈心草的薄層色譜鑒別取“2.1.2”項下供試品溶液。另取燈心草對照藥材0.2 g同法制成對照藥材溶液。參照《藥典》燈心草藥材薄層鑒別項下色譜條件展開，見圖5。

圖5　燈心草TLC圖譜

4.燈心草對照藥材，5.缺燈心草陰性樣品

2.2含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(30∶70)；柱溫：25 ℃；檢測波長：238 nm；進樣量：

10 μL，運行時間：12 min。

2.2.2溶液制備①供試品溶液的制備：精密稱量同一批號八正顆粒0.3 g，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，取續濾液，即得。②對照品溶液的制備：取在60 ℃減壓干燥4 h的梔子苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含232 μg的溶液，即得。③陰性溶液的制備：按照八正顆粒的處方比例和制法，制備缺梔子的陰性對照樣品，按照供試品溶液的制備項下方法制備成陰性對照溶液。

2.2.3系統適應性試驗分別取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，在“2.2”項下色譜條件，各進樣10 μL，記錄HPLC圖譜。見圖6。結果顯示，梔子苷保留時間為9.22 min，與其他成分分離良好，不受其他成分干擾，理論塔板數按梔子苷計，不低于5 000。

圖6　梔子苷的HPLC圖譜

2.2.4線性關系精密量取對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻。上述溶液依次進樣，進樣量10 μL，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標、梔子苷濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，梔子苷在2.32～46.4 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好，回歸方程為Y=14.49 X-1.390，r=0.999 9，線性范圍2.32～46.4 μg/mL。

2.2.5精密度試驗精密吸取上述對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄梔子苷峰面積，其RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩定性試驗取上述同一供試品溶液(批號：20140901)，分別在0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，其RSD為0.78%，結果表明，供試品溶液放置24 h內穩定性良好。

2.2.7重復性試驗取同一批次供試品(批號：20140901) 6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，梔子苷的平均含量為1.871 μg/mg，RSD為1.95%，表明方法的重復性良好。

2.2.8加樣回收率試驗稱取已知含量(含梔子苷1.871 μg/mg)的同一批八正顆粒約0.15 g，精密稱定，分別加入梔子苷對照品儲備液1.1 mL，按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液，測定梔子苷的含量，計算回收率。梔子苷平均加樣回收率為99.41%，RSD為1.46%。結果見表1。

2.2.9樣品的含量測定取3批八正顆粒(批號：20140501、20140901、20141101)，按“2.2.1”項下方法，制備供試品溶液，“2.2.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算梔子苷的含量，結果見表2。

3討論

3.1薄層鑒別在鑒別試驗中，對原標準中大黃和梔子的鑒別進行了修訂。考察了《藥典》大黃和梔子藥材鑒別項下的提取方法，考慮到梔子和大黃在八正顆粒制法中分別為50%乙醇提取和水提取，本試驗又考察了文獻中超聲提取的方法，提取溶劑分別對比了二氯甲烷、甲醇和水，最終確定大黃鑒別采用二氯甲烷超聲提取，梔子采用甲醇提取的方法，節省了操作時間，簡化了操作步驟，保證了檢驗工作的有效性和高效率[4]。

表1　梔子苷加樣回收率試驗

表2　三批樣品的含量測定結果(μg/mg)

本試驗在原有標準基礎上，增加了車前子、甘草和燈心草的薄層鑒別。車前子鑒別試驗：考察了文獻中車前子藥材的薄層鑒別方法，發現采用《藥典》法，毛蕊花糖苷和梔子苷有明顯的干擾，二者化學位移非常接近，因此本試驗采用了聚酰胺薄膜為固定相，甲醇-冰醋酸-水為展開劑，365 nm紫外光下觀察，陰性樣品無干擾[6]。甘草鑒別試驗，考察了《藥典》成方制劑百合固金口服液(含有水提取甘草成分)中甘草鑒別項下展開劑系統，比較了四相展開劑系統乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)和三項展開劑系統乙酸乙酯-甲酸-水(7∶0.5∶1)，二者差別不大，最終采用了相對簡單的三項系統。燈心草在原處方制法中為藥材粉末直接入藥，因此本試驗采用了《藥典》中燈心草藥材的鑒別條件，以超聲提取代替回流提取，簡化了提取條件。

本試驗對大黃、梔子、車前子、甘草的鑒別，均采用對照藥材和對照品同時對照。采用對照品為對照，能保證檢出被測組分的有效性；采用對照藥材為對照，可保證藥材鑒別的全面性，避免被鑒別藥材因在制劑中添加指標性成分而不能檢出未添加的假陽性現象。

3.2梔子苷含量測定本試驗對原標準中梔子苷的含量測定進行了修訂。采用文獻中50%甲醇超聲提取的方法，提取效率優于原標準中稀乙醇溶解的方法[4]。分別對比了《藥典》和文獻方法，對流動相比例、檢測波長和色譜柱均進行了考察，最終確定了“2.2.1”項下的色譜條件[4,7-8]。梔子苷含量限度的擬定，根據八正顆粒中梔子苷處方量為118 g，《藥典》梔子藥材含量測定項下規定，含梔子不低于1.8%，按其提取轉移率不低于70%計，1 000 g成品中含有梔子苷應不低于1.49 g。每袋10 g計，每袋含梔子以梔子苷計不低于14.9 mg。以此標準計算，本試驗考察的3批八正顆粒的含量均符合標準。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015.

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[4]盛望鵬.八正顆粒質量標準的改善研究[J].中國生化藥物雜志,2014,4:164-168.

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[8]賀康洪,侯佳寧,張紫東,等.HPLC法測定肝血管瘤活血膠囊中梔子苷的含量[J].解放軍藥學學報,2014,6:530-531,534.

Improvement in quality standard for bazheng granules

SHI Ya-zhu1,LIU Gui-yan2*,LI Xian2,LI Chun-ton2,FENG Chun-jin2

(1.NO.203 Hospital of PLA,Qiqihaer 161000,China;2.Department of Pharmacy,First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish the quality standard for Bazheng granules.MethodsFive major components (including rheum officinale,fructus gardenia,semen plantaginis,medulla junci and radix glycyrrhiza) were identified by TLC.The content of geniposide was determined by HPLC.ResultsThe spots of TLC of all varieties were distinctive with good reproducibility,and there was no interference with the negative references.Geniposide had good linear relation during 2.32～46.4 μg/mL (r=0.9999).The average recovery was 99.41% with RSD 1.46% (n=6).ConclusionTLC and HPLC methods are rapid and accurate with good reproducibility,so it is effective for the quality control of Bazheng granules.

Key words：Bazheng granules;Quality standard;TLC;HPLC

收稿日期：2015-09-14

基金項目：軍隊醫療機構制劑標準提高科研專項課題(14ZJ-Z20-3)

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604024

*通信作者