miR-210通過下調JAK-STAT信號通路抑制膽囊癌細胞增殖的實驗研究

陜西省安康市中心醫院普外科(安康 725000)　邱　偉　楊成琳　 劉　陽

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miR-210通過下調JAK-STAT信號通路抑制膽囊癌細胞增殖的實驗研究

陜西省安康市中心醫院普外科(安康 725000)邱偉楊成琳 劉陽▲

摘要目的：探討miR-210抑制膽囊癌細胞系GBC-SD增殖的機制是否與下調JAK-STAT通路有關。方法：Real-time PCR法檢測10例膽囊癌與癌旁組織中miR-210、STAT3、STAT5的表達；采用LipofectamineTM2000將miR-210-mimic轉染至膽囊癌GBC-SD細胞以及JAK-STAT信號通路特異性阻滯劑AG490處理GBC-SD細胞后，分別檢測細胞內miR-210、STAT3、STAT5表達的變化,通過MTT實驗、流式細胞儀檢測miR-210對GBC-SD細胞增殖、細胞周期的影響。結果：膽囊癌組織中miR-210的表達低于癌旁組織,STAT3、STAT5的表達高于癌旁組織(P<0.05)；miR-210轉染、AG490處理后GBC-SD細胞內STAT3、STAT5的表達下降；miR-210將GBC-SD細胞阻滯于G0/G1期并抑制細胞增殖。結論：miR-210下調GBC-SD細胞內STAT3、STAT5的表達,通過阻滯JAK-STAT信號通路從而抑制GBC-SD細胞增殖。

主題詞膽囊腫瘤/病理學微RNAsSTAT3轉錄因子 STAT5轉錄因子

膽囊癌是膽管系統常見的惡性腫瘤,是一種早期診斷困難、生存期較短、病死率較高的惡性腫瘤[1]。中晚期膽囊癌的根治手術療效欠佳，輔助放化療的治療效果局限,5年生存率波動于5%～10%[2]。因此,尋找膽囊癌特異性的診斷標志物、有效的治療靶點是目前膽囊癌的研究熱點。有研究發現多種microRNA(miRNA)在膽囊癌組織與正常膽囊組織或癌旁組織中存在差異表達[3],miRNA是由18～24個核苷酸構成的內源性非編碼小分子單鏈RNA,miRNA轉錄后參與調控血管生成、腫瘤侵襲和轉移等過程[4]。已有研究證實miR-210可通過下調多種信號通路抑制腫瘤細胞增殖。本課題旨在研究miR-210在膽囊癌組織和癌旁組織中表達的差異,并從細胞分子水探討miR-210抑制膽囊癌細胞系GBC-SD增殖的機制與下調JAK-STAT通路的關系，為探索膽囊癌潛在的治療靶點提供理論支持。

材料與方法

1材料膽囊癌細胞系GBC-SD,購自中國科學院上海細胞生物學研究所；JAK-STAT信號通路特異性阻滯劑AG490,購自美國Sigma公司；miR-210-mimic、STAT3引物、STAT5引物、β-actin引物由上海生物工程技術服務有限公司合成；Trizol購自美國Amresco公司；轉染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM,購自美國Invitrogen公司。10例膽囊癌與癌旁組織(距癌灶邊緣3 cm)均取自2012年1月至2014年12月我院普外科患者,所有組織標本均為手術切除并經過病理證實,10例膽囊癌患者平均年齡58.2±7.35歲，其中男6例,平均年齡61.3±8.45歲；女4例,平均年齡56.8±7.21歲。

2方法①Real-time PCR法檢測膽囊癌與癌旁組織miR-210、STAT3、STAT5的表達：將膽囊癌與癌旁組織標本研磨成粉(研磨過程中加入少量液氮)，使用Trizol法提取膽囊癌與癌旁組織總RNA并逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應條件：42℃，15 min；95℃,2 min。利用 Primer Premier 5軟件設計目的基因引物,引物序列通過BLAST進行比對均具有特異性,miR-210的上游引物序列為 CTGTGCGT-GTGACAGCGGCTGA,下游引物為通用引物Uni-miR real-time PCR引物；STAT3上游引物5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′,下游引物5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′；STAT5上游引物5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′,下游引物5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′；β-actin上游引物5′-CCAGGTCATCACCATCGG-3＇,β-actin下游引物5′- CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3′。以cDNA為模版,β-actin為內參,使用SYBR Primix Ex Taq Ⅱ( TaKaRa試劑盒) 進行Real-time PCR檢測,反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸40 s,總計40個循環。根據公式 Folds=2-△△Ct來計算目的基因的相對表達量,其中△△Ct=(Ct檢測基因-Ctβ-actin)實驗組-(Ct檢測基因-Ctβ-actin)對照組。②miR-210-mimic轉染 GBC-SD細胞：用DMEM完全培養基(含5 %胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 mg/L)培養GBC-SD細胞，細胞培養箱的條件：5 %CO2、溫度37 ℃，pH7.2～7.4,濕度為95 %。經過3～4次傳代后,選取生長狀態良好的處于對數生長期的GBC-SD細胞,胰酶消化后以1×105/孔的濃度接種6孔板,放入培養箱中培養24 h，使細胞融合率達到30 %～50 %后棄去培養液。配制轉染試劑：將FAM熒光標記的miR-210-mimic(20 pmol)溶于Opti-MEM配制成20 μmol/L的溶液,用Opti-MEM(50 μl)稀釋LipofectamineTM2000(1 μl)并充分混勻,室溫孵育5 min,將FAM熒光標記的miR-210-mimic和LipofectamineTM2000混合,室溫孵育20 min。然后將miR-210-mimic和LipofectamineTM2000混合物加入到GBC-SD細胞6孔板中并輕輕搖晃混勻,置于培養箱孵育4～6 h,熒光顯微鏡下檢測并計算miR-210-mimic轉染效率，Real-time PCR法檢測轉染前后miR-210、STAT3、STAT5的表達水平。選取生長狀態良好的處于對數生長期的GBC-SD細胞,棄去培養液，加入AG490，使其終濃度為40 μmol/L，繼續培養24 h，Real-time PCR法檢測AG490處理GBC-SD細胞后miR-210、STAT3、STAT5的表達水平。③MTT 法檢測miR-210-mimic轉染對GBC-SD細胞增殖的影響：按照上述方法將miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞,將轉染后的GBC-SD細胞按照1×104個/孔的濃度接種于96孔板并置于37℃、5 %的CO2培養箱中培養,轉染24、48、72、96 h后加入20 μl的MTT試劑,置于37℃、5 % CO2培養箱中孵育4 h后,每孔加入150 μl的 DMSO溶解,小心振蕩10 min,在酶聯免疫檢測儀490 nm波長處測定每孔光密度(OD)值；另取處于對數生長期的GBC-SD細胞,加入JAK-STAT信號通路特異性阻滯劑AG490,使其終濃度為40 μmol/L,培養24、48、72、96 h后棄去培養液,加入20 μl的MTT試劑,繼續孵育4 h后,每孔加入150 μl的 DMSO溶解,小心振蕩10 min,在酶聯免疫檢測儀490 nm波長處測定每孔OD值。另設對照孔(每孔加200 μl的GBC-SD細胞懸液)。以上各組均設置6個平行孔,實驗重復3次,計算各組的細胞抑制率,細胞抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。④流式細胞儀檢測轉染miR-210-mimic對GBC-SD細胞周期的影響：將GBC-SD細胞以1×105個/孔接種于6孔板中,培養箱中培養24 h,按照上述方法將miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞(miR-210-mimic組)，胰酶消化后，1000 rpm離心5 min,1 ml的PBS(4℃預冷)洗滌,1000 rpm離心5 min后棄去上清液，加入10 μl的Annexin Ⅳ-FITC和5μl的PI，避光室溫反應15 min,加入300 μl結合緩沖液后上流式細胞儀檢測，實驗重復3次。另設未轉染組、AG490處理組(終濃度為40 μmol/L)，各組細胞檢測過程同miR-210-mimic組。

結果

1膽囊癌組織、癌旁組織中miR-210、STAT3、STAT5的表達見圖1。膽囊癌組織中miR-210的表達水平低于癌旁組織(P<0.05)，而STAT3、STAT5的表達水平高于癌旁組織(P<0.05)。結果提示，膽囊癌組織中，miR-210的低表達以及STAT3、STAT5的高表達可能與膽囊癌的發生、發展有關。

2miR-210-mimic轉染、AG490處理GBC-SD細胞后STAT3、STAT5的表達變化見圖2。miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后，轉染效率高達91.07%±3.85%，miR-210表達較轉染前升高2.35±0.53(P<0.05)，說明 miR-210-mimic已成功轉染至GBC-SD細胞。miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后STAT3、STAT5的表達分別為轉染前的0.35±0.062,0.23±0.044,差異均有統計學意義(P<0.05)。AG490處理GBC-SD細胞后STAT3、STAT5表達分別為轉染前的0.30±0.058,0.24±0.046,差異均有統計學意義(P<0.05),AG490處理與miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后STAT3、STAT5的表達無統計學差異(P>0.05)。

與癌旁組織比較，* P<0.05

圖1膽囊癌組織、癌旁組織中miR-210、STAT3、STAT5表達

與轉染前比較，* P<0.05

圖2miR-210-mimic、AG490對GBC-SD細胞內miR-210、STAT3、STAT5表達的影響

3miR-210對GBC-SD細胞增殖的影響見圖3。通過測定轉染miR-210-mimic的GBC-SD細胞增殖曲線，發現miR-210可明顯抑制GBC-SD細胞的增殖，miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后24、48、72、96 h的增殖抑制率分別為34.2%±2.68%，55.3%±4.65%，64.8%±5.06%，82.1%±2.57%，與未轉染組均有統計學差異(P<0.05)。AG490處理GBC-SD細胞后24、48、72、96h的增殖抑制率分別為38.7%±2.81%,60.2%±4.33%,68.3%±5.22%，85.5%±5.33%,與miR-210-mimic轉染組24、48、72、96 h細胞增殖抑制率的差異均無統計學意義(P>0.05)。

4miR-210對GBC-SD細胞周期的影響見圖4。miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后,處于G0/G1期的細胞百分比為71.16%±4.28%,較未轉染組明顯增多47.82%±2.37%,差異有統計學意義(P<0.05)；處于S期的細胞百分比為11.95%±0.84%，較未轉染組減少34.81%±1.77%,差異有統計學意義(P<0.05)；miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞前后，處于G2/M的細胞百分比分別為15.73%±1.22%、13.95%±0.99%，差異無統計學意義(P>0.05)；40 μmol/L的AG490處理GBC-SD細胞后處于G0/G1、S、G2/M期的細胞百分比分別為67.23%±1.84%、13.19%±1.08%、17.56%±0.88%，與miR-210-mimic轉染組的差異均無統計學意義(P>0.05)。

與未轉染組比較，* P<0.05

圖3 miR-210、AG490對GBC-SD細胞增殖的影響

與miR-210-mimic轉染前比較,* P<0.05

討論

膽囊癌占膽道系統腫瘤的80%～95%，占消化系統腫瘤第5位，由于早期癥狀不典型，缺乏有效的治療手段，因此預后極差[5]。Kiran等[6]報道膽囊癌患者的中位生存期為4個月。因此探索膽囊癌的發病機制以及潛在的有效治療靶點有著非常重要的臨床意義，有研究發現膽囊癌細胞的增殖在膽囊癌的發生、發展過程中起著關鍵作用[7]。大量文獻報道miR-210在胰腺癌、淋巴瘤、結直腸癌、乳腺癌、肝癌中表達升高,起癌基因樣作用,在食管鱗癌組織中表達降低,可能具有抑癌基因樣作用[3]。袁源[7]通過miRNA芯片比較正常膽囊上皮細胞與GBC-SD細胞的miRNA差異表達時發現,150個miRNA在GBC-SD細胞中存在差異表達,其中上、下調的miRNA分別有89、61個,miR-210在GBC-SD細胞中表達較正常膽囊上皮細胞低(比值為0.114)，但對miR-210在膽囊癌發生、發展過程中的具體機制并未闡述。我們通過檢測miR-210在膽囊癌與癌旁組織中的表達也發現miR-210在膽囊癌組織中也呈低表達(與癌旁組織比較)。

有研究發現JAK-STAT 信號通路與癌細胞形成和增殖密切相關，JAK-STAT信號通路廣泛分布于各種腫瘤細胞中,STAT3、STAT5是JAK-STAT信號通路中的關鍵分子，與多種實體腫瘤的發生、發展有關[8]。我們利用Real-time PCR法檢測膽囊癌與癌旁組織中STAT3、STAT5的表達,發現STAT3、STAT5在膽囊癌組織中呈高表達(與癌旁組織比較)。有學者依據TargetScan預測并證實了miR-210的下游靶基因是STAT3,我們的研究也證實了這一點，在miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后,STAT3、STAT5的表達明顯降低,與使用JAK-STAT信號通路特異性阻滯劑AG490后STAT3、STAT5的表達無明顯差異。AG490是人工合成的JAK-STAT信號通路特異性阻滯劑,分子結構與酪氨酸類似,可通過與受體酪氨酸激酶競爭結合位置從而抑制STAT磷酸化，是研究JAK-STAT信號通路的重要分子工具。Yang等[9]發現miR-210能明顯降低肝癌細胞活性,誘導腫瘤細胞停滯于G0/G1期。我們通過miR-210-mimic轉染GBC-SD細胞后發現細胞的增殖受到明顯抑制,細胞增殖曲線趨勢與使用AG490相似,與未轉染組的GBC-SD細胞增殖均存在統計學差異,表明miR-210可以抑制GBC-SD細胞的增殖,通過細胞周期檢測發現miR-210可將GBC-SD細胞阻滯于G0/G1期,這可能是miR-210抑制GBC-SD細胞增殖的主要原因。將腫瘤細胞阻滯于G0/G1期可提高細胞對放療敏感性,這對膽囊癌根治手術后的輔助性治療極為關鍵。

總之，miR-210在膽囊癌組織中呈低表達,miR-210的高表達可將GBC-SD細胞阻滯于G0/G1期從而抑制細胞增殖，其分子機制可能與下調JAK-STAT信號通路有關，然而對miR-210在膽囊癌發病機制中的具體作用仍有待于進一步研究。

參考文獻

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(收稿：2015-12-25)

MiR-210 inhibits gallbladder carcinoma cell proliferation by blocking JAK-STAT signaling pathway Department of General Surgery, Ankang City Central Hospital (Ankang 725000)

Qiu WeiYang ChenglinLiu Yang

ABSTRACTObjective：To explore whether miR-210 inhibits gallbladder carcinoma cell proliferation by blocking JAK-STAT signaling pathway.Methods: The expressions of miR-210、STAT3、STAT5 were detected in 10 pairs of gallbladder cancer and paracancerous tissues by Real-time PCR; MiR-210 mimic was transfected into GBC-SD by LipofectamineTM2000 and GBC-SD was also disposed by JAK-STAT signaling pathway blocker AG490, and then the cell proliferation and cell cycle were tested by MTT and flow cytometry. Results: The down-regulation of miR-210 and up-regulation of STAT3, STAT5 were observed in the gallbladder cancer tissues (P<0.05); the expressions of STAT3、STAT5 was lower in GBC-SD disposed by MiR-210 mimic and AG490 than untransfected group; MiR-210 inhibited cell proliferation by blocking GBC-SD into G0/G1 phase. Conclusion: MiR-210 inhibits the expressions of STAT3, STAT5 and GBC-SD cell proliferation by blocking JAK-STAT signaling pathway.

KEY WORDSGallbladder neoplasm/pathologyMicroRNAsSTAT3Transcription factorSTAT5 Transcription factor

通訊作者：▲西安交通大學第二附屬醫院普外科

【中圖分類號】R735.8

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.004