反相高效液相色譜法測定枯草桿菌二聯活菌顆粒中甜菊糖苷的含量

孫 菲 孫 欣

反相高效液相色譜法測定枯草桿菌二聯活菌顆粒中甜菊糖苷的含量

孫 菲 孫 欣

【摘要】目的 建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定枯草桿菌二聯活菌顆粒中甜菊糖苷的含量。方法 選用AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，線性梯度洗脫，流動相為乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液；檢測波長為210 nm；流速1.0 ml/min；進樣量10 μl；柱溫30 ℃。結果 甜菊糖苷的線性范圍為5.160～103.2 g/ml（r=0.9999，n=7）；提取回收率為99.04%（RSD為0.6%，n=6）。結論 本法操作簡便、準確，可用于枯草桿菌二聯活菌顆粒的質量控制。

【關鍵詞】枯草桿菌二聯活菌顆粒；含量測定；甜菊糖苷；反相高效液相色譜法

雞西市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江雞西 158100

甜菊素又稱甜菊糖或甜菊糖苷，是一種天然的甜味劑，文獻［1-5］報道其高甜度、低熱量、穩定性好、安全性高，且具有降血糖、抑菌等特性，被廣泛應用于各類食品、飲料、醫藥、日化工業，作為藥用輔料收載在《中國藥典》中。枯草桿菌二聯活菌顆粒為兒童專用藥品，適用于因腸道菌群失調引起的腹瀉、便秘、脹氣、消化不良等。甜菊素作為枯草桿菌二聯活菌顆粒輔料中的甜味劑，現行標準未對其含量進行質量控制，反相高效液相色譜（RP-HPLC）法排除了其他成分的干擾，可以準確地檢測出枯草桿菌二聯活菌顆粒中甜菊糖苷的含量，為藥物質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP1100高效液相色譜儀（安捷倫公司），HP1100工作站（自動進樣，紫外檢測器），METTLER TOLEDO電子天平（XSE 205），JAC-40型超聲波清洗器（功率：300 W，頻率：40 KHz，濟寧市奧波超聲電器有限公司），UV-2550紫外-可見分光光度計（蘇州島津）。

1.2 試藥 甜菊糖苷對照品（20150701，含量98.0%，曲阜圣仁制藥有限公司），市售枯草桿菌二聯活菌顆粒3批（北京韓美藥品有限公司，批號：20150531、20150419、20150509），水為娃哈哈純凈水，乙腈（TEDIA）色譜純，甲醇（科密歐）色譜純，磷酸（天津市恒興化學試劑制造有限公司）分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性實驗 選用AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，流動相以乙腈（A）-0.002 mol/L磷酸溶液（B），按照表1比例，進行線性梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測波長為210 nm；進樣量10 μl；柱溫30 ℃。理論板數以甜菊糖苷計不低于7000，甜菊糖苷與相鄰峰的分離度均符合要求。

表1 線性梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取甜菊糖苷對照品21.06 mg（含量98.0%）置20 ml量瓶中，加乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液（25：75）適量，超聲使其溶解，加上述溶液稀釋至刻度，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品適量（約1 g）置100 ml量瓶中，加乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液（25：75）40 ml，超聲提取10 min（功率：300 W，頻率：40 KHz），放置至室溫，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液1.0 ml置20 ml量瓶中，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按枯草桿菌二聯活菌顆粒的處方，不加甜菊素，依法制備陰性樣品，按2.2.2項下供試品溶液制備的方法制備陰性對照溶液。分別取對照溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，微孔濾膜濾過，按上述色譜條件，分別進樣，色譜圖見圖1。

圖1 對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液HPLC色譜圖（1為甜菊糖苷）

2.3 線性關系考察 精密量取2.2.1項下的對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、2.0 ml置20 ml量瓶中，按上述色譜條件，分別進樣10 μl，以色譜峰面積Y對應進樣濃度X（μg/ml）進行回歸分析，可得：甜菊糖苷回歸方程Y=29.27X-2.562，r=0.9999 （n=7），甜菊糖苷在5.160～103.2 μg/ml濃度范圍內線性良好。

2.4 精密度實驗 精密量取2.2.1項下的對照品溶液0.5 ml置20 ml量瓶中，加乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液（25：75）至刻度，得濃度為25.80 μg/ml對照品溶液。搖勻，微孔濾膜濾過，連續重復進樣5次，每次10 μl，記錄色譜圖峰面積，測得甜菊糖苷峰面積值的RSD為0.4%（n=5），實驗結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性實驗 精密稱取樣品適量（約1 g），按2.2.2項下方法制備成供試品溶液，分別在供試品溶液配制后的0、2、4、8、12、16、24 h，按上述色譜條件，分別進樣10 μl，記錄色譜圖峰面積，測得甜菊糖苷峰面積的RSD為0.5%（n=7），實驗結果表明甜菊糖苷在24 h內穩定。

2.6 重復性實驗 分別精密稱取同一批號供試品（批號：20150531）5份，按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別進樣10 μl，記錄色譜圖峰面積，測量甜菊糖苷的平均含量為39.28 mg/袋，RSD為0.8%（n=5），實驗結果表明方法重復性較好。

2.7 回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（批號：20150531）約0.5 g，6份，分別置100 ml量瓶中，另精密稱取甜菊糖苷對照品相當于甜菊糖苷純品20 mg，6份，分別置上述100 ml量瓶中，按2.2.2項下的方法制備溶液，用微孔濾膜濾過，進樣10 μl，結果甜菊糖苷平均回收率為99.04%（RSD=0.6%，n=6），見表2。

表2 甜菊糖苷回收率實驗測定結果

2.8 樣品含量測定 取本品6袋，精密稱定，混勻，研細，精密稱取本品適量（約相當于1 g）按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，每一批號平行制備3份供試品溶液，按上述色譜條件，分別進樣10 μl，記錄色譜圖峰面積，根據峰面積外標法計算3批市售樣品中甜菊糖苷的含量，結果見表3。

表3 市售枯草桿菌二聯活菌顆粒含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取對照品溶液在190～500 nm波長范圍內進行紫外掃描，在210 nm波長處有最大吸收，故檢測波長設為250 nm，實驗圖譜基線平穩，效果較好。

3.2 色譜選擇 實驗過程中分別考察了AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和AgiLent Zobax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱。實驗結果表明，150 mm短柱柱效較250 mm長柱低，且甜菊糖苷保留時間過短，甜菊糖苷色譜峰和相鄰色譜峰不能有效分離，選用250 mm長柱取得了較好的分離效果。

3.3 流動相的考察 實驗過程中分別考察了以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液為流動相，結果表明乙腈-0.002 mol/L磷酸溶液為流動相，甜菊糖苷色譜峰形最好，且保留時間適宜。

3.4 文獻［6］報道了容量法和RP-HPLC法測定甜菊糖苷含量的比較，表明RP-HPLC法能有效排除干擾，更加客觀準確。待測物質甜菊糖苷分離出后，采用梯度洗脫能快速洗脫其他物質，排除實驗干擾，有效提高分離效率，充分體現RP-HPLC法的高效、準確、便利等特性。

3.5 甜菊糖苷具有“天然、綠色、安全、保健”等諸多優點，文獻［7-8］探討了甜菊素代替蔗糖在中藥制劑中應用，在未來的醫藥發展中甜菊素作為甜味劑應用將更加廣泛。藥用輔料質量對藥品的體內溶出、釋放、代謝都起著重要作用，隨著藥品質量標準的不斷提高和完善，藥品輔料逐漸增加到標準中，因此本法的建立是對現行標準的有效補充和提高。

參考文獻

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Determination of Steviosin in Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live By RP-HPLC

Sun Fei Sun Xin

【Abstract】Objective To establish RP-HPLC method for determination of Steviosin in Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live.Methods Using a column packed with AgiLent Zobax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；The mobile phase was acetonitrile-0.002 mol/L H3pO4by gradient elution and the detection wavelength was 210 nm；the flow rate was 1.0ml/min，the injection volume was 10 μl，the column temperature was 30 ℃.Results The Linear response of Steviosin range from 5.160～103.2 μg/ml r=0.9999（n=7）；The average recovery of Steviosin was 99.04%，RSD= 0.6%（n=6）.Conclusion The method is convenient and accurate and can be used for the quality control of Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live.

【Key words】Combine Bacillus Subtilis and Enterococcus Faecium Granules with Multivitamines，live；Determination；Steviosin；RP-HPLC

【中圖分類號】R927.2

【文獻標志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.06.004

作者簡介：孫菲（1981.12-），副主任藥師。研究方向：藥品檢驗。E-mail：chenlizhu1980@163.com