胡蘆巴堿、五味子油和二甲雙胍聯合治療對糖尿病大鼠糖脂代謝和Neuritin表達的影響

魏建宏，喬麗平

（1.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽032200；2.山西省汾陽醫院，山西汾陽032200）

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胡蘆巴堿、五味子油和二甲雙胍聯合治療對糖尿病大鼠糖脂代謝和Neuritin表達的影響

魏建宏1，喬麗平2

（1.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽032200；2.山西省汾陽醫院，山西汾陽032200）

摘要：目的研究探討胡蘆巴堿、五味子油和二甲雙胍聯合治療對2型糖尿病大鼠糖脂代謝和海馬區Neuritin表達的影響。方法采用鏈脲佐菌素+高糖、高脂飼料喂養，建立2型糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠分為糖尿病模型組、藥物聯合治療和羅格列酮組，每組11只大鼠，連續給藥8周。另取10只正常SD大鼠作為正常對照組。檢測各組大鼠空腹血糖（FBG），糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹血清胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、肝糖原和肌糖原水平，實時聚合酶鏈反應、Western blot檢測分析海馬區Neuritin表達水平。結果給藥8周后，糖尿病模型組大鼠FBG、HbA1c、FINS、TC、TG升高，胰島素敏感指數（ISI）、肝糖原和肌糖原水平、海馬Neuritin mRNA及蛋白表達水平下降，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與糖尿病模型組比較，藥物聯合治療組和羅格列酮組大鼠FBG、HbA1c、FINS水平下降，而ISI、肝糖原和肌糖原水平、海馬Neuritin mRNA及蛋白表達水平上升，差異有統計學意義（P＜0.01）；藥物聯合治療組與糖尿病模型組比較，TC、TG下降，差異有統計學意義（P＜0.01），而與羅格列酮組TC、TG比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論胡蘆巴堿、五味子油和二甲雙胍聯合治療能改善糖尿病大鼠糖脂代謝和海馬區Neuritin表達。

關鍵詞：胡蘆巴堿；五味子油；2型糖尿病；糖脂代謝；海馬Neuritin

隨著人們生活水平的提高及飲食結構的改變，糖尿病的患病率呈快速上升趨勢，預計2030年我國糖尿病患者將達1.297億。2型糖尿病是由胰島素抵抗伴胰島素分泌不足，或伴胰島素分泌缺陷而導致的一種糖代謝紊亂疾病。糖尿病患者多體型肥胖，常伴有高脂血癥，其血脂、血糖控制不好將誘發后期的一系列并發癥，如眼、腎、心、骨骼肌、周圍和中樞神經等［1-2］。胡蘆巴堿（Trigonelline）是胡蘆巴種子中的主要生物堿之一，可存在于紫茉莉根、南瓜的果實、咖啡豆及馬鈴薯等植物中，具有降血糖和降血脂的作用［3］。五味子是一種藥物的果實，能對人體心、肝、脾、肺、腎發揮平衡作用，酸能生津，具益氣、生津、止渴之功，故為治療消渴的常用藥［4］。二甲雙胍能減輕體重，降低胰島素抵抗，是治療2型糖尿病的常用藥物。

糖尿病軸突神經并發癥的發病原因之一是神經營養因子產生和支持減少。而Neuritin又名可塑性相關候選基因15，是近年來新發現的一個神經營養因子，是一種與神經可塑性相關的神經營養因子，能促進樹突和軸突的生長和突觸成熟，調節突觸回路的形成［5］。其是一條編碼糖基磷脂酞肌醇錨定的糖蛋白基因，在神經組織中表達最多，其中以海馬齒狀回最高，其次為大腦皮層和小腦。Neuritin作為神經活動和神經營養素共同作用于下游因子，在阻止神經細胞凋亡、促進突觸成熟、保護運動神經元等方面發揮作用。

目前在伴有高脂血癥的糖尿病患者的防治方面尚無特殊措施，因此，尋找具有調節血脂且對糖尿病及其并發癥有預防和治療作用的天然抗糖尿病藥物，己成為國內外研究的一個熱點。胡蘆巴堿、五味子油等中藥在糖尿病患者中的應用研究，有利于促進中藥的開發、研究和應用，有助于提高糖尿病患者的生活質量，減少糖尿病及其并發癥的發生，為我國乃至全世界眾多的糖尿病患者及血糖偏高者提供一種新的藥物，具有良好的社會效益和廣闊的臨床應用前景。

1材料與方法

1.1 2 型糖尿病大鼠模型的建立

SD大鼠50只，由武漢大學動物實驗中心提供（周齡8～9周，250～280g，健康，清潔級，許可證號：2003-0004），將動物隨機分為4組。正常對照組10只，正常喂養；其余動物進行高糖、高脂飼料喂養建模，然后隨機分為糖尿病模型組、藥物聯合治療組、羅格列酮組。建模方法是腹腔注射鏈脲菌素35 mg/kg，3 d后取血測量空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），建模成功的指標為空腹血糖＞16.7 mmol/L。共建模成功大鼠34只。高糖、高脂飼料為標準飼料∶白糖∶豬油∶雞蛋=70∶9∶12∶9。

1.2 實驗分組及給藥

將33只糖尿病大鼠隨機分為藥物聯合治療組（胡蘆巴堿20 mg/kg、五味子油1.0 mg/kg、二甲雙胍0.5 g/次）、糖尿病模型組、羅格列酮組（羅格列酮＜4 mg/kg）。2個月內對大鼠進行灌胃給藥，用生理鹽水對正常對照組和糖尿病模型組灌胃。每15天測1次指標（空腹血糖），稱2次體重，然后調整藥量。

1.3 標本采集及處理

2個月后禁食大鼠，用戊巴比妥鈉麻醉，測定血糖，開胸取血，每只大鼠取10 ml全血，取腦組織，分離海馬，液氮凍存。

1.4 實時聚合酶鏈反應檢測海馬中Neuritin mRNA和蛋白表達

按照RNAiso Plus試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）說明書提取RNA，進行逆轉錄合成cDNA。按SYBR說明書操作配制反應體系，進行實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，Realtime PCR）擴增。對樣品重復試驗，取平均值。所用擴增引物及基因片段長度見表1，以Actan為內參基因，行定量分析。

采用Western blot檢測Neuritin蛋白。將30～60μg樣品放在十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用硝酸纖維素膜進行轉印，封閉液封閉。一抗反應，加入用封閉液稀釋的一抗10 ml（抗Neuritin、Actin特異性抗體，1∶1 000稀釋），漂洗濾膜；二抗反應，用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應抗體稀釋濃度為1∶2 000，漂洗濾膜。增強化學發光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，暗室曝光，顯影、定影，自來水充分沖洗。用Mixrotek ScanWizard 5軟件進行電腦掃描、Quantity one 7.0圖像分析軟件做灰度分析。

表1　PCR引物序列

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因數方差分析，兩兩比較用LSD法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 胡蘆巴堿、五味子油和二甲雙胍對血糖、血脂及糖化血紅蛋白水平的影響

各組大鼠血糖、血脂及糖化血紅蛋白水平比較，經重復測量設計方差分析，差異有統計學意義（F=48.165、47.515和68.904，P=0.000）。糖尿病模型組FBG水平與正常對照組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（t=19.587，P=0.021），糖尿病模型組FBG水平升高。1和2個月后，藥物聯合治療組、羅格列酮組FBG水平比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（t=25.632和31.25，P=0.012和0.011），2個月后藥物聯合治療組、羅格列酮組FBG水平較1個月后降低，隨時間延長血糖水平水平下降明顯，羅格列酮組空腹血糖最低。見表2。

表2　各組大鼠FBG水平比較的方差分析結果（mmol/L，±s）

表2　各組大鼠FBG水平比較的方差分析結果（mmol/L，±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與糖尿病模型組比較，P＜0.05

組別　　給藥前　1個月后　2個月后正常對照組　5.53±0.77　 5.49±0.94　 5.48±0.21糖尿病模型組　20.96±5.351）23.67±1.64　 22.31±2.142）藥物聯合治療組　22.73±3.741）17.56±1.872）9.83±1.372）羅格列酮組　21.28±3.571）11.37±1.412）8.03±1.072）F值　48.165　47.515　68.904 P值　0.000　0.000　0.000

糖尿病模型組總膽固醇（total cholesterol，TC）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）、三酰甘油（Triglycerides，TG）水平與正常對照組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（t=27.698、24.545和22.417，P=0.011、0.009和0.005），糖尿病模型組TC、HbA1c、TG水平較正常對照組升高。藥物聯合治療組TC、HbA1c、TG水平與糖尿病模型組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（t=21.634、19.375和17.247，P=0.023、0.020和0.017），藥物聯合治療組TC、HbAlc、TG水平較糖尿病模型組降低。見表3。

表3　各組大鼠HbAlc、TC、TG水平比較的方差分析結果（±s）

表3　各組大鼠HbAlc、TC、TG水平比較的方差分析結果（±s）

注：1）與正常對照組比較P＜0.05；2）與糖尿病模型組比較，P＜0.05

組別　HbAlc/％　TC/（mmol/L）　TG/（mmol/L）正常對照組　14.41±2.69　 1.84±0.33　 0.84±0.12糖尿病模型組　35.15±6.241）2.74±0.48　 2.12±0.10藥物聯合治療組　23.51±5.131）2）2.21±0.541）2）1.13±0.171）2）羅格列酮組　19.63±4.151）2）2.72±0.631）2）1.99±0.121）2）F值　37.791　13.798　21.458 P值　0.000　0.000　0.000

2.2 各組大鼠空腹血清胰島素水平及肝臟和骨骼肌糖原含量比較

各組大鼠空腹血清胰島素（fasting serum lisulin，FINS）水平、肌糖原、胰島素敏感指數（insulin resistance index，ISI）、肝糖原比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=35.791、12.708、22.458和10.356，P=0.000）。糖尿病模型組FINS、肌糖原、ISI、肝糖原與正常對照組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（t=15.623、9.476、16.324和28.764，P=0.018、0.009、0.020和0.029），糖尿病模型組FINS較正常對照組升高，而肌糖原、ISI、肝糖原則降低。藥物聯合治療組、羅格列酮組的空腹胰島素、ISI、肝糖原和肌糖原與糖尿病模型組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（藥物聯合治療組：t=19.231、16.324、28.264和9.476，P=0.013、0.014、0.011和0.017；羅格列酮組：t=19.231、8.654、9.231和13.452，P=0.013、0.027、0.017和0.014），藥物聯合治療組和羅格列酮組的FINS較糖尿病模型組降低，而ISI上升，肝糖原和肌糖原含量也增加，恢復至接近正常對照組大鼠水平。見表4。

表4　各組大鼠血清胰島素水平及肝臟和骨骼肌糖原含量比較的方差分析結果（±s）

表4　各組大鼠血清胰島素水平及肝臟和骨骼肌糖原含量比較的方差分析結果（±s）

注：1）與正常對照組比較，P＜0.05；2）與糖尿病模型組比較，P＜0.05

組別　FINS/（uIU/ml）　　胰島素敏感指數正常對照組　34.48±1.78　-5.13±0.07糖尿病模型組　70.01±9.681）-7.38±0.131）羅格列酮組　39.12±3.471）2）-5.65±0.141）2）藥物聯合治療組　40.53±4.951）2）-5.98±0.251）2）F值　35.791　12.708 P值　0.000　0.000肝糖原/（mg/g）　　肌糖原/（mg/g）19.79±1.53　1.70±0.15 12.17±1.141）0.90±0.131）19.15±2.431）2）1.63±0.121）2）17.51±1.671）2）1.55±0.161）2）22.458　10.356 0.000　0.000

2.3 藥物對海馬Neuritin mRNA和蛋白表達的影響

各組大鼠海馬Neuritin mRNA和蛋白表達比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=12.701 和10.128，P=0.000）。糖尿病模型組大鼠海馬Neuritin蛋白及mRNA的表達水平與正常對照組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（t=8.579和9.845，P=0.021和0.031），糖尿病模型組大鼠海馬Neuritin蛋白及mRNA的表達水平較正常對照組降低。藥物聯合治療組、羅格列酮組小鼠海馬中Neuritin mRNA和蛋白表達與糖尿病模型組比較，經LSD檢驗，差異有統計學意義（藥物聯合組:t=12.687和14.321，P=0.011和0.024；羅格列酮組：t=16.745和16.984，P=0.022和0.021），藥物聯合治療組、羅格列酮組小鼠海馬中Neuritin mRNA和蛋白表達較糖尿病模型組增加（見表5）。采用Western blot檢測各組海馬Neuritin蛋白表達水平（見附圖）。

表5　各組大鼠海馬Neuritin mRNA和蛋白表達比較的方差分析結果（±s）

表5　各組大鼠海馬Neuritin mRNA和蛋白表達比較的方差分析結果（±s）

注:1）與正常對照組比較，P＜0.01；2）與糖尿病模型組比較，P＜0.01

組別　Neuritin mRNA　Neuritin蛋自正常對照組　1.00±0.00　0.062±0.002糖尿病模型組　0.53±0.031）0.033±0.0021）藥物聯合治療組　0.97±0.062）0.057±0.0022）羅格列酮組　1.02±0.052）0.063±0.0072）F值　12.701　10.128 P值　0.000　0.000

A：正常對照組；B：糖尿病模型組；C：藥物聯合治療組；D：羅格列酮組附圖　Western blot檢測海馬Neuritin蛋白表達水平

3　討論

2型糖尿病患者常伴有脂代謝紊亂、高血脂，干擾胰島素在周圍組織中與受體結合，導致胰島素生物效應降低，升高血液中胰島素水平。胡蘆巴堿有降血糖、降低膽固醇、促進神經組織再生、抗癌、鎮靜等功效，能改善胰島素抵抗、保護胰島β細胞，具有抗氧化作用［6-8］。瘦素是脂肪細胞分泌的肽類激素，具有調節糖脂代謝的作用，有研究顯示，五味子油能使糖尿病大鼠瘦素水平、血清游離脂肪酸水平及穩態胰島素評價指數降低，改善糖尿病大鼠胰島素作用，從而抑制瘦素分泌，減輕胰島素抵抗，減少肝臟葡萄糖的產生［9］。

本研究在建模過程中為大鼠注射鏈脲菌素，糖尿病模型組動物在飲食和飲水量上比正常對照組動物多，且空腹血糖、糖化血紅蛋白、FINS均升高，提示建模成功，而TG、TC升高，說明大鼠存在糖脂代謝紊亂。陽性對照藥選用羅格列酮，其在調整糖脂代謝過程中發揮作用，具有降低膽固醇和血糖、促進神經組織再生、抗氧化、鎮靜等功。實驗證實效羅格列酮能明顯降低糖尿病大鼠血中FBG、HbA1c水平，提高ISI，與很多研究結果一致［10-12］。與正常大鼠比較，糖尿病模型組大鼠肝臟和骨骼肌中糖原含量較低，說明肝臟和骨骼肌中糖原貯存能力受到損傷，而經藥物聯合治療后，肝糖原和肌糖原含量提高，可能與藥物提高胰島素敏感性有關。而胡蘆巴堿能抑制FINS和ISI的作用，保護胰島β細胞。在高血糖水平下，海馬受到損傷導致海馬神經元數量減少，神經元的凋亡增加，神經元形態變異或功能失常，從而引起相關的功能障礙［5］。糖尿病模型成年大鼠海馬中Neuritin的轉錄及表達蛋白水平較低，與相關文獻報道一致［13-14］，而羅格列酮能促進Neuritin在糖尿病大鼠海馬中的表達［15，10］，提示胡蘆巴堿、五味子油、二甲雙胍聯合治療可上調Neuritin轉錄，促進神經元功能的修復。

胡蘆巴堿、五味子油、二甲雙胍聯合治療具有降血糖、促進大腦皮層神經元樹突和軸突再生、保護中樞神經、改善高脂血癥、促進糖脂代謝紊亂的恢復、修復海馬損傷的作用。其防治神經病變的機制尚需研究。

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（童穎丹編輯）

Effect of combined treatment of trigonelline，Fructus Schisandrae oil and Metformin on glucose and lipid metabolisms and hippocampal neuritin expression in type 2 diabetic rats

Jian-hong Wei1，Li-ping Qiao2
（1. Fenyang College of Shanxi Medical University，Fenyang，Shanxi 032200，China；2. Shanxi Fenyang Hospital，Fenyang，Shanxi 032200，China）

Abstract:Objective To observe the effect of trigonelline，Fructus Schisandrae oil and Metformin therapy on neuritin expression in hippocampal area and glucose and lipid metabolisms in rats with type 2 diabetes. Methods Type 2 diabetic rat model was established by feeding Streptozotocin plus high-sugar and high-lipid diet. The diabetic rats were divided into diabetic model group，combined drug treatment group and Rosiglitazone group with 11 rats in each group. The rats received continuous treatment for 8 weeks. The normal control group consisted of 10 normal SD rats. FBG，HbA1c，TC，FINS，TG，liver glycogen and muscle glycogen levels were tested. Real-time PCR and Western blot were used to determine neuritin expression level in hippocampus. Results Compared with the normal control group，the FBG，HbA1c，FINS，TC and TG levels were increased significantly；the insulin sensitivity index（ISI），liver glycogen and muscle glycogen levels，hippocampal neuritin mRNA and protein expressions were decreased significantly in the diabetic model group after treatment for 8 weeks（P＜0.01）. Compared with the diabetic model group，the FBG，HbA1c and FINS levels were significantly decreased；but ISI，liver glycogen and muscle glycogen levels，and the expression levels ofhippocampal neuritin mRNA and protein were significantly increased in the combined drug treatment group and Rosiglitazone group（P＜0.01）. Compared with the diabetic model group，TC and TG decreased significantly in the combined drug treatment group（P＜0.01）；but there were no significant differences in TC or TG between the diabetic model group and the Rosiglitazone group（P＞0.05）. Conclusions Combined trigonelline，Fructus Schisandrae oil and Metformin therapy can improve glucose and lipid metabolisms and expression of neuritin in the hippocampus of type 2 diabetic rats.

Keywords:trigonelline；Fructus Schisandrae oil；type 2 diabetes；glucose and lipid metabolisms；hippocampal neuritin

中圖分類號：R587.1

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.005

文章編號：1005-8982（2016）011-0024-05

收稿日期：2015-07-09