過表達microRNA-29a上調鋅脂蛋白91對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞凋亡的影響*

劉永敏，段　萍，鄢文海，何　芳，唐　娜，鐘　華

（1.石河子大學醫學院病理生理教研室，新疆石河子832002；2.鄭州大學基礎醫學院生理學教研室，河南鄭州450001；3.鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室，河南鄭州450001）

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過表達microRNA-29a上調鋅脂蛋白91對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞凋亡的影響*

劉永敏1，段萍2，鄢文海3，何芳1，唐娜1，鐘華1

（1.石河子大學醫學院病理生理教研室，新疆石河子832002；2.鄭州大學基礎醫學院生理學教研室，河南鄭州450001；3.鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室，河南鄭州450001）

摘要：目的建立高感染效率、穩定過表達microRNA-29a（miR-29a）的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12），探索miR-29a對PC12細胞凋亡的影響。方法將miR-29a前體表達載體、空白對照載體進行慢病毒包裝，用病毒上清感染PC12并進行抗性篩選。實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測miR-29a的表達，流式細胞術檢測miR-29a穩定過表達組、空質粒對照組以及未感染組PC12細胞的凋亡情況，利用TargetScan 6.0數據庫預測miR-29a的關鍵靶點，RT-qPCR以及Western blot檢測預測的miR-29a下游靶基因mRNA以及蛋白表達的變化。結果經抗性篩選后獲得穩定表達miR-29a的PC12細胞系，熒光顯微鏡下觀察各組PC12細胞的感染效率均達80％以上，miR-29a過表達組凋亡率為（5.1±0.92）％，空質粒對照組為（1.832±0.26）％，未感染組為（1.667±0.185）％，miR-29a過表達促進PC12細胞凋亡（P＜0.01），空質粒對照組與未感染組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義；RT-qPCR檢測miR-29a過表達時鋅指蛋白91（ZFP91）的表達量升高，miR-29a過表達組ZFP91 mRNA的表達量是空質粒對照組的1.835倍（P=0.000），空質粒對照組與未感染組ZFP91 mRNA的表達量比較差異無統計學意義；Western blot檢測的ZFP91蛋白表達量與空質粒對照組比較也升高。結論在PC12中miR-29a過表達促進PC12細胞凋亡，過表達miR-29a也促進ZFP91表達，其機制仍待進一步闡明。

關鍵詞：microRNA-29a；鋅指蛋白91；細胞凋亡；大鼠；嗜鉻細胞瘤細胞；實時熒光定量聚合酶鏈反應

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的、長18～25 nt的非編碼小分子RNA。miRNA通過直接結合目標基因的3'-非翻譯區（3'- untranslated region，3'-UTR）或編碼序列（coding sequence，CDS），調節其轉錄后水平，該調節可能通過抑制mRNA的蛋白質翻譯或促進降解mRNA。miR-29a是miR-29家族成員之一，于2001年Lagos-Quintana等［1］在人Hela細胞中克隆獲得的，定位于人染色體7q32.3的負鏈。目前，研究已確定人類miR-29廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。

miRNA在調控細胞凋亡方面作用顯著，已有很多研究表明miR-29a在很多腫瘤組織中的表達下調（如腦膠質瘤［2］，慢性淋巴細胞白血病［3］、急性髓性白血病等［4］），同時也有一些研究表明miR-29在心血管疾病［5］、神經退行性疾病［6-7］、艾滋病［8-10］中也出現異常高表達，通過調控下游靶基因促進正常細胞凋亡，從而引起相關疾病。miR29a對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（pheochromocytoma cells，PC12）凋亡的影響及其相應靶基因的調控研究目前仍缺乏報道。本研究通過慢病毒介導miR-29a前體表達載體感染PC12細胞，采用流式細胞術檢測PC12細胞凋亡的變化，用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、Western blot檢測下游靶基因鋅指蛋白91（zinc finger protein 91，ZFP91）表達的變化，進一步豐富miR-29a促進PC12細胞凋亡相關理論，為闡明miR-29在神經退行性疾病發生中的作用機制提供科學依據，為其防治提供新靶標。

1材料與方法

1.1 實驗試劑

miRNA-29a前體表達克隆RmiR6139-MR03、對照質粒CmiR60001-MR03，均帶有增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），以及Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit均購自廣州GeneCopoeia公司，無血清培養基Ⅰ購自美國Sigma公司，High glucose達爾伯克必需基本培養基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均購自美國Hyclone公司，藻紅蛋白-Annexin Apoptosis Detection Kit以及異硫氰酸熒光素-Annexin Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司，總RNA提取試劑盒（Trizol）購自北京天根生化科技有限公司，cDNA第一鏈試劑盒、SybrGreen PCR Master Mix（2×）購自大連寶生生物工程有限公司，ZFP91及β-Actin抗體均購自美國Santa Cruz公司，嘌呤霉素購自北京Solabio公司。

1.2 細胞培養

大鼠嗜鉻瘤PC12細胞由鄭州大學醫學院干細胞中心饋贈，人胚腎細胞293T細胞株由鄭州大學基礎醫學院病理生理教研室陳萍老師饋贈，兩種細胞均用High-glucose DMEM和10％FBS培養。

1.3 慢病毒包裝

包裝前24 h，分別接種4×106～5×106個293T細胞到2個100 mm培養皿中。按照慢病毒包裝試劑盒（Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit）說明書，分別包裝miRNA-29a前體表達質粒、對照質粒，孵育過夜（8～14 h）換新鮮培養基，再培養48 h收獲病毒上清，500×g離心10 min去除細胞碎片。病毒上清可馬上用于感染，或分裝置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.4 慢病毒感染PC12細胞、抗性篩選以及計算感染效率

感染前24 h接種2×105個/孔的PC12細胞于6孔板，病毒感染時細胞50％～70％融合。每孔分別加miR-29a前體表達質粒和對照質粒的病毒上清液各200μl，并各加入終濃度為4μg/ml的聚凝胺。感染24 h后，吸出原培養基，換終濃度為1.5μg/ml嘌呤霉素培養基進行篩選。之后每3天更換抗性培養基，連續篩選14 d，分別命名這兩組細胞為miR29a-PC12和EGFP-PC12-control（空質粒對照組）。計算感染效率有兩種方法：①通過流式細胞儀檢測表達綠色熒光蛋白的細胞數占總細胞數的百分比來計算感染效率，該方法得到的感染效率很精確；②通過4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核染色，熒光顯微鏡下選取同一個視野，分別數熒光細胞個數，計算EGFP陽性細胞百分比=EGFP陽性細胞數/DAPI陽性細胞數×100％，隨機選取幾個視野求均數，該方法可以粗略計算感染效率。

1.5 流式細胞術檢測兩組細胞的凋亡率

用0.25％的胰酶消化細胞，將細胞懸液移至流式管中，1 000 r/min離心5min，棄上清液，磷酸鹽緩沖溶液洗2遍，離心棄上清液。將細胞重懸于Annexin ⅤBinding Buff中，再各加入4μl PE-AnnexinⅤ和4μl 7-氨基放線菌素（7-AAD），輕柔混勻，室溫避光放置15 min，每管各加入200μl 1×AnnexinⅤBinding Buffer，混勻，1 h內上機檢測。

1.6 RT-qPCR檢測miR-29a下游的靶基因

引物序列：ZFP91正向引物：TGCGACATGCGAA ACATCATA，反向引物：GTGTACTGCCAGATTGTGG GAAC。各組細胞總RNA提取，cDNA第一鏈逆轉錄試劑盒逆轉錄cDNA，在冰上配置反應體系（20μl）：Sybr Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR Forward Primer（10μmol）0.5μl，PCR Reverse Primer （10μmol）0.5μl，Rox Reference Dyell（50×）0.4μl，cDNA模板（≤100 ng）2.0μl，ddH2O 6.0μl。兩步法PCR擴增程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s。

1.7 Western blot檢測miR29a下游靶蛋白的變化

提取各組細胞的總蛋白并定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，調節電壓，使過分離膠120 V，基層膠60 V，以染料的前沿遷移至凝膠的底部為標準終止電泳。恒定電流70 mA轉膜1 h。5％脫脂奶粉封閉膜，一抗孵育4℃搖床過夜，加辣根酶標記山羊抗小鼠lgG（1∶5 000）37℃孵育1 h，增強化學發光法顯色，顯影定影，沖洗膠片，對條帶進行灰度分析。

1.8 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 慢病毒包裝

在倒置顯微鏡下觀察293T細胞，呈三角形，或多角形，貼壁生長，排列整齊。病毒包裝前細胞達到70％～80％匯合（見圖1包裝前），病毒包裝48 h后，293T細胞胞體略微回縮變圓，細胞狀態變差，培養皿內漂浮著少量死細胞（見圖1包裝后），熒光顯微鏡下觀察，在慢病毒包裝后293T細胞發出大量綠色熒光（見圖1熒光顯微鏡下包裝后）。

圖1　慢病毒包裝前后的293T細胞（×40）

2.2 穩定過表達miR-29a細胞株建立

慢病毒感染后，經過2周的嘌呤霉素篩選，分別篩選出穩定過表達miR29a-PC12細胞株及EGFPPC12-control細胞株（見圖2），PC12細胞株的整個胞體都有綠色熒光蛋白表達，通過DAPI核染色熒光顯微鏡下觀察細胞核發出藍色熒光，通過計算EGFP陽性細胞百分比，miR-29a-PC12的感染率為83.7％ （72/84），空質粒對照組感染率為88.4％（93/105）。

圖2　中每一橫列為同一視野細胞在自然光下、熒光顯微鏡下DAPI核染色后藍色熒光以及熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白的表達情況圖2　穩定過表達miR29a-PC12細胞株及EGFP-PC12-control細胞株（×40）

2.3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

各組細胞凋亡率經方差分析得出，各組細胞凋亡率差異有統計學意義（F=12.099，P=0.008），進一步兩兩比較發現，MiR-29a過表達PC12細胞凋亡率顯著高于空質粒對照組（P＜0.01），說明MiR過表達可以促進PC12細胞凋亡，而空質粒對照組與未感染組比較，細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3和表1。

圖3　過表達miR-29a對PC12細胞凋亡的影響

表1　各組PC12細胞的凋亡率比較（n=3，％，±s）

表1　各組PC12細胞的凋亡率比較（n=3，％，±s）

注：1）流式細胞術檢測細胞凋亡率，計算方法：表達凋亡蛋白的細胞數（流式凋亡圖的Q4象限）/表達綠色熒光蛋白的細胞數× 100％；2）通過Dunnett（雙側）兩兩比較，將EGFP- PC12-control設為對照組，將其與其他各組進行兩兩比較

組別　　細胞凋亡率1）F值　P值　P值2）（兩兩比較）未感染組　1.667±0.185 12.099　 0.008　 0.972空質粒對照組　1.823±0.26　1.000 miR-29a過表達組　5.1±0.92　0.011

2.4 各組PC12細胞ZFP91 mRNA及蛋白質的表達水平

本研究前期利用Target Scan 6.0數據庫以及Pictar 5數據庫預測ZFP91可能是MiR-29a下游的靶基因，通過RT-qPCR及Western blot對各組PC12細胞的ZFP91 mRNA和蛋白表達進行檢測驗證，結果顯示，miR-29a過表達時ZFP91 mRNA和蛋白質的表達升高，miR-29a過表達組ZFP91的表達量是空質粒對照組的1.835倍（P=0.000），未感染組與空質粒對照組相比ZFP91 mRNA及蛋白質表達量的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2和圖4、5。

表2　各組ZFP91 mRNA及蛋白質的表達比較（n=3，±s）

表2　各組ZFP91 mRNA及蛋白質的表達比較（n=3，±s）

注：?與空質粒對照組比較，P＜0.05

組別　ZFP91 mRNA　ZFP91蛋白相對倍數　F值　　相對倍數　F值　P值未感染組　1.113±0.048 14.320 0.000 0.941±0.211 21.990 0.000空質粒對照組　1　1 P值miR-29a過表達組　1.835±0.211?2.17±0.47?

圖4　各組PC12細胞的ZFP91 mRNA及蛋白質表達

圖5　Western blot檢測各組ZFP91蛋白的表達

3　討論

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤分化細胞株，具有神經內分泌細胞的一般特征。本實驗擬以PC12細胞為研究對象，通過慢病毒介導的miR-29a前體感染PC12細胞，使miR-29a在PC12細胞中過表達，慢病毒感染后再經過嘌呤霉素篩選，成功獲得穩定過表達miR-29a的PC12細胞系，該細胞系可以穩定傳代、凍存及復蘇，為后續實驗奠定良好基礎。

miR-29a是miR-29家族中的一員，其存在于第7號染色體7q32上。已有很多研究證明miR-29a在腫瘤組織中低表達，提示miR-29a可抑制腫瘤細胞的增殖，促進凋亡，其機制主要有miR-29a過表達可抑制NF-ΚB信號途徑［11］，直接抑制DNA甲基轉移酶的活性［12］以及激活Caspase途徑［13］，誘導細胞凋亡。本研究也證實，miR-29a可促進PC12細胞凋亡，而在細胞培養中本研究發現一些有意義的現象：①經過相同的培養條件培養48 h后，miR-29a過表達組和對照組的培養基顏色明顯不同，miR-29a過表達組的培養基依舊為紅色，而空質粒對照組和未感染組的培養基為橙黃色；②在相同的接種密度下，miR-29a過表達組細胞的增殖速度較空質粒對照組慢。基于上述現象，筆者分析認為由于培養液中有指示劑酚紅存在，故培養基顏色的變化可間接提示細胞生長的狀態，miR-29a過表達可能抑制PC12細胞的增殖，使細胞生長狀態變差，產酸減少，所以在經過48 h細胞培養后培養基還為紅色，這也從另一個角度印證miR-29a過表達促進PC12細胞凋亡而抑制其增殖。

ZFP91是編碼63.4 kD的核蛋白，含有5個連續的鋅指結構域，屬于鋅指蛋白家族。ZFP91最早在人類急性髓性白血病模型中被發現，認為它在促進細胞增殖以及抗細胞凋亡中起重要作用，抑制ZFP91的表達可顯著增加細胞凋亡率［14］。后續又有研究報道ZFP91在前列腺癌以及前列腺癌細胞系，例如前列腺淋巴結癌及人前列腺癌細胞、DU145、22Rv1中高表達［15］，其機制可通過泛素化和激活絲裂原活化蛋白激酶3K14進而主動調控非經典的核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路［15-16］。在結核桿菌感染子宮內膜癌Ishikawa細胞系模型中ZFP91隨感染時間先升高后降低，這與結核桿菌感染后泛素蛋白酶體系統活化有關［17］。本研究前期利用Target Scan 6.0數據庫以及Pictar 5數據庫預測ZFP91的3'-非翻譯區有miR-29a的結合位點，ZFP91可能是miR-29a的靶基因，RT-qPCR 及Western blot驗證后發現，miR-29a在PC12中長期、穩定地過表達時ZFP91的表達是上調的，這與傳統意義上miRNA通過結合到靶基因的3'-UTR或編碼序列進而下調靶基因mRNA或蛋白質的經典理論不相符，提示miRNA調控下游靶基因的方式可能不止靶向抑制這一種，還可以通過穩定和上調靶基因進而調控細胞的增殖和凋亡以及生物學特性。筆者推測可能的原因是：①由于miRNAs的網絡調節特點，幾個miRNA可以共同調控一個基因的表達，miR-29a在PC12細胞中過表達，可能影響到其他miRNA或其他表觀遺傳學調控，進而影響ZFP91的表達；②外源性miR-29a過表達抑制細胞增殖而促進凋亡，而PC12細胞自身可能會產生應激來抵抗這種作用。已有文獻報道，miR-29過表達可以抑制NF-κB信號通路的激活［11，18］，而ZFP91作為一個抗凋亡基因，其也是NF-κB信號通路的一個重要的調控元件，ZFP91通過泛素化作用，激活和穩定E3泛素連接酶［19］及MAP3K14來激活非經典的NF-κB信號途徑，以削減miR-29a過表達對NF-κB信號通路的抑制作用，它的表達量增加可以有效對抗miR-29a促進細胞凋亡。

綜上所述，miR-29a可以促進PC12細胞凋亡，并提示ZFP91與miR-29a及細胞凋亡有著必然的聯系，其機制可能是ZFP91作為一個抗凋亡蛋白激活非經典的NF-κB信號通路來抵制miR-29a的促凋亡作用，進一步豐富miR-29a促進神經細胞凋亡的相關理論，為神經退行性疾病的防治提供新思路。

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（申海菊編輯）

Overexpression of microRNA-29a up-regulates zinc finger protein 91 expression and regulates cell apoptosis in PC12*

Yong-min Liu1，Ping Duan2，Wen-hai Yan3，Fang He1，Na Tang1，Hua Zhong1
（1. Department of Pathophysiology，Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832002，China；2. Department of Physiology，3. Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001，China）

Abstract:Objective To establish a rat adrenal pheochromocytoma cell line（PC12）with highly-infective efficiency and stable overexpression of miR-29a，and to explore the role of miR-29a in apoptosis of PC12. Methods The miR-29a precursors expressing viral vectors（Lvx-miR-29a-eGFP）and control vector（LvxeGFP-control）were packaged to Lentivirus respectively，and PC12 cells were infected by Lentivirus and underwent resistance screening. Flow cytometry（FCM）was used to detect the cell apoptosis，and then real time quantitative PCR（RT-qPCR）and Western blot were used to measure the levels of targets gene mRNA and protein of miR-29a. Results PC12 cell lines with high infection efficiency and stable overexpression of miR-29a were established，the EGFP-positive cell percentage was over 80％in the infected PC12 cells. miR-29aoverexpression significantly increased cell apoptosis rate in PC12 when campared to the eGFP-control group and non-infection group（P＜0.01），and significantly up-regulated the mRNA and protein levels of zinc finger protein 91（ZFP91）in the PC12. Conclusions Our study demonstrated overexpression of miR-29a can effectively up-regulate ZFP91 expression and promote apoptosis of PC12. Its mechanism remains to be further elucidated.

Keywords:microRNA 29a；zinc finger protein 91；cell apoptosis；PC12；RT-qPCR；rat

中圖分類號：R736.6

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.004

文章編號：1005-8982（2016）011-0018-06

收稿日期：2015-12-28

*基金項目：石河子大學優秀青年科技人才培育計劃（No：2013ZRKXYQ25）