山東省某豬場豬偽狂犬病的診斷鑒定及防治措施

劉 準，臧傳佼，易新健，陳申秒，3*

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省病原微生物實驗室，山東 濱州 256600；3.山東省博萊威生物技術研究所，山東 濱州 256606）

山東省某豬場豬偽狂犬病的診斷鑒定及防治措施

劉 準1，2，臧傳佼1，易新健1，2，陳申秒1，2，3*

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省病原微生物實驗室，山東 濱州 256600；3.山東省博萊威生物技術研究所，山東 濱州 256606）

為了確診一起豬偽狂犬病的發生，采集送檢病料的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、腦等組織器官進行實驗室診斷和PCR檢測。結果顯示，病料中擴增出了偽狂犬病病毒的特異性gE基因片段，通過對PCR擴增產物進行序列比對分析，發現此次發生的偽狂犬病與2011年之后流行的偽狂犬流行毒株高度同源。綜合流行病學、病理解剖、實驗室診斷，確定引起此次疾病的主要病原為豬偽狂犬病毒。

豬偽狂犬；流行毒株；診斷

偽狂犬病毒（PRV）是由皰疹病毒引起的可以多種動物共患的急性、熱性傳染病。病毒可以通過直接接觸和間接接觸在易感豬中傳播，一般流行較快，發病較急。目前，疫苗免疫是防治本病的主要手段，豬場必須通過合理的疫苗免疫程序才能控制和消滅該病。但由于疫苗免疫不充分和疫苗不合理應用仍會造成該病的發生。自2011年以來，一種由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病在我國爆發，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失[1]。2016年2月，山東省廣饒縣某養殖場育肥豬群爆發疑似偽狂犬病，經流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理剖檢和實驗室診斷，最終確診本次疫情為豬偽狂犬病，現報道如下。

1 發病情況

據場主自述自2016年2月10號起，豬群中有豬只出現呼吸道癥狀，體溫升高到41.5℃左右，之后大群陸續發病并出現呼吸道癥狀，當地獸醫診斷為喘氣病，讓其拌料飼喂泰妙菌素和氟苯尼考等藥物，同時對于食欲廢絕的豬只注射頭孢等抗生素，藥物治療后體溫回降，但大群呼吸道癥狀一直未見好轉，斷斷續續仍然有豬只死亡。發病豬日齡主要集中在4～5月齡的育肥豬，100頭左右。其中圈舍中有三圈育肥豬癥狀較為嚴重，豬只趴伏不起，精神沉郁，采食減退或廢絕。育肥豬群除在3日齡滴鼻豬偽狂犬病弱毒活疫苗，30日齡和60日齡分別免疫過2次豬瘟疫苗，其他疫苗均未免疫。豬群情況不容樂觀。養殖場遂于3月1號攜帶2頭病豬至沃華生物分子檢測中心求診，查找病因。

2 臨床癥狀及剖檢病變

病豬體溫升高在41℃左右，精神不振，食欲減退或廢絕。病豬呈典型的腹式呼吸，咳嗽，呼吸困難，病豬未見消瘦情況。其中，有1頭病豬有典型的神經癥狀，盲目轉圈，側臥，四肢劃水狀。豬只死亡一段時間之后口鼻流出泡沫狀帶血的液體。

剖檢病死豬兩頭，病理變化主要表現為腹股溝淋巴結腫大、充血，頜下淋巴結充血、腫脹、壞死（圖1，A）；胸腔和腹腔有大量淡黃色透明狀液體，肺臟高度水腫，呈黑紅花斑狀（圖1，B）；扁桃體出血、潰瘍嚴重（圖1，C）；喉頭會厭軟骨出血（圖1，D），氣管內有白色泡沫，肝臟腫脹，表面有些灰白色的壞死灶；脾臟腫大（圖1，E），腎臟腫大，腦有嚴重的充血積血（圖1，F）。綜合以上剖檢癥狀，初步診斷為偽狂犬感染。

圖1 病理剖檢Fig.1 Pathologic autopsy

3 實驗室診斷

3.1 細菌分離 無菌采取心包積液、肝臟、肺臟等進行細菌分離培養，接種在含小牛血清及NAD的TSA瓊脂平板上培養24 h，結果無致病菌生長。

3.2 PCR診斷 采集豬的腦、肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結等組織的病變部位，采用RT-PCR和PCR的方法檢測豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒、偽狂犬病毒等病原。

3.2.1 引物設計 根據GenBank上公布的偽狂犬病毒基因設計合成1對gE基因特異性擴增引物。引物序列：P1：5’-GACCCCAAGCGCGCC-3’，P2：5’-CGCGTAGTACCAGTCCAGCGT-3’。

3.2.2 病毒DNA提取 采集腦、肝、脾、淋巴結、扁桃體等組織器官進行研磨勻漿，反復凍融3次后用OMEGA公司試劑盒（貨號D3892-02）對病毒核酸進行提取。

3.2.3 PCR擴增 使用TaKaRa公司（貨號DDR20AG）試劑盒進行PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）：DNA 2 μL，2×GC buffer I 2.5 μL，MgCl2（25 μM）1.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，Taq 0.3 μL，ddH2O 14.7 μL。 PCR反 應 程 序 ： 94 ℃ 預 變 性5 min；94℃變性1 min、53℃退火30 s、72℃延伸1 min 30 s，共進行35個循環；72℃延伸10 min后4℃保存。

4 結果與分析

4.1 判定 實驗室PCR檢測結果（圖2），除偽狂犬gE陽性外，其他CSFV、PCV-2、PRRSV等病毒結果陰性。綜合臨床及剖檢癥狀，判斷該豬群發病的主要原因是由豬偽狂犬病毒感染導致。

圖2 PCR檢測結果Fig.2 Results of PCR

4.2 gE基因的測序 對PCR擴增的目的片段進行連接、轉化和測序，將測序結果與GenBank上國內外不同時間的毒株進行同源性分析，發現該毒株與2011年以后流行的毒株同源性高達99.5%，通過對gE基因構建遺傳進化樹發現，本次疫情所分離的毒株與2011年以后的國內的分離毒株親緣關系較近，屬于一個分支，與11年之前的國內分離到的一些經典毒株同屬一個大分支，而與國外的一些毒株親緣關系較遠（遺傳進化樹如圖3）。

5 防控措施

針對發病的豬群緊急接種偽狂犬弱毒疫苗2.5頭份，同時在飲水中加入多維，連用7 d，以減少疾病帶來的應激，在飼料中添加保肝護腎和黃芪多糖等中藥，減輕疾病和前期用藥對肝臟和腎臟的損傷，增強抵抗力，同時也有利于豬群后期的恢復。經過實地觀察發現，疫苗免疫后2 d未見明顯好轉，發病后期的豬（主要為腹式呼吸的豬只）仍有個別死亡，第3天癥狀較重的三圈舍的育肥豬有幾只可以自由活動，采食。其他圈舍咳嗽、氣喘的豬只癥狀明顯減輕。疫苗免疫后第5天，豬只大群狀態基本正常，病情逐漸得到控制，總共死亡5頭，死亡率為5%。由于判斷及時準確，疫苗免疫后成功控制住病情的發展。

6 討論

圖3 遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree

2011年以來，新一輪的偽狂犬病疫情在我國大部分地區爆發，新的疫情主要是架子豬和育肥豬出現典型的呼吸道癥狀[2]。國內許多研究報道表明，我國目前大部分地區流行的偽狂犬病毒發生了變異[3-6]。哈爾濱獸醫研究所通過對當前流行的偽狂犬病毒進行全基因組以及各基因序列進行比較分析，首次提出了偽狂犬病毒存在兩個主要的基因型，并且兩個基因型之間具有一定的地域性。歐美國家的毒株主要是基因Ⅰ型，亞洲國家的毒株主要是基因Ⅱ型，我國流行的偽狂犬毒株以基因Ⅱ型為主[7]。另外有研究報道，Bartha-k61株產生的中和抗體對目前變異毒株的中和能力遠低于Bartha-k61株，表明偽狂犬變異毒株與經典強毒株和傳統疫苗株存在一定的抗原差異[1，8-9]。在免疫保護方面，Bartha-k61株疫苗免疫后，用變異毒株進行攻毒，豬群出現發熱、呼吸道癥狀和排毒，有部分豬只出現神經癥狀，但未出現豬群死亡現象[9-10]。

對于本次豬場爆發的偽狂犬病，通過對gE基因進行同源比較和遺傳進化分析發現，引起豬場致病的野毒與2011年之后國內分離到的流行變異株有很高的同源性，為新的偽狂犬病變異毒株。另外通過對豬群緊急免疫偽狂犬弱毒活疫苗，很好的控制住豬場的疫情表明，經典株的疫苗仍能對變異株產生有效保護。對于防控目前流行的偽狂犬，增加經典株的接種次數，能夠對豬群提供堅強持久的保護[11]。萬遂如教授[12]指出豬場不合理的使用疫苗，降低疫苗的免疫頻率，致使免疫空白期延長；另外，一些豬場頻繁更換疫苗，有的豬場在兩年時間更換了4個廠家的疫苗（雙基因缺失疫苗、單基因缺失疫苗、弱毒活疫苗），在一定程度上為偽狂犬病毒的重組提供了條件，以上情況都給偽狂犬病毒的流行帶來了很多風險。

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[10]Wang CH,Yuan J,Qin HY,et al.A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China [J].Vaccine,2014,32:3379-3385.

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The diagnostic identification and prevention measures of Pseudorabies Virus from pig farm in Shandong Province

Liu Zhun1,2,Zang Chuanjiao1,Yi Xinjian1,2,Chen Shenmiao1,2,3
（1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd.,Shandong Binzhou 256600; 2.Shandong pathogenic microbiology laboratory,Shandong Binzhou 256600; 3.Shandong Bolaiwei Biological Technology Institute,Shandong Binzhou 256606)

To diagnose a suspected pseudorabies case,pathologic autopsy was performed and tissues of the pigs were collected for virus isolation and identification using PCR.The PRV gE gene was amplified from the tissues and its infection was confirmed.The swine Pseudorabies Virus was determined combined with epidemiology,anatomical pathology,laboratory diagnosis.The PCR product were analyzed by sequence alignment and showed that the isolate strain of this case shared highly homologous to the other strains that had been isolated after 2011,and confirmed the occurrence of this case was caused by a new wild pseudorabies virus.

Swine pseudorabies;Epidemic strain;Diagnose

S858.28

：B

：1672-9692(2016)09-0033-05

2016-07-20

劉準（1984-），男，山東萊陽人，碩士，研究方向：動物傳染病的防控研究。

陳申秒（1983-），男，山東鄆城人，碩士，助理研究員，研究方向：動物傳染病的診斷與防治。