檢測牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

孫光野，張 露，王珊珊，侯喜林

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

檢測牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

孫光野，張 露，王珊珊，侯喜林*

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

為了建立一種快速檢測牛奶中布魯氏菌的方法，本研究采用套式PCR的方法，通過對PCR條件的優化，改進布魯氏菌提取DNA方法，經驗證，最佳退火溫度50.1℃、dNTP最佳濃度為0.2 mM、引物最佳濃度為0.4 μM 、Taq DNA聚合酶最佳濃度為0.1 μL、本方法最小檢測菌數為8個。說明用套式PCR的方法提高了檢測牛奶中布魯氏菌的敏感性。

布魯氏菌；套式PCR；奶樣

布魯氏菌病于1859年由Morston首次報道[1]，是由布魯氏桿菌引起的一種全世界廣泛分布的人獸共患慢性細菌傳染病。世界動物衛生組織（OIE）已將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病[2]。

布魯氏菌病（Brucellosis）病原是布魯氏桿菌（Brucella），它是革蘭氏陰性的兼性細胞內寄生菌，主要侵害動物的淋巴系統和生殖系統，可以引發世界范圍內人和牲畜及野生哺乳動物的感染[3]。目前，流行病學、臨床病理變化、細菌學和血清學等方法均能診斷本病[4-5]。血清學診斷方法有很多，包括平板凝集反應、試管凝集反應、虎紅平板凝集反應、補體結合反應[6]、ELISA等，雖然上述方法均可檢測布魯氏菌病，但由于檢測結果不夠精確，存在假陰性可能，均不能適應現代快速檢驗檢疫需求。實際臨床操作時往往需要多種方法結合應用，成本較高，耗費時間。因此，尋求一種快速檢測奶樣布魯氏菌的方法迫在眉睫，本文利用CTAB/NaCl方法提取牛奶樣品的布氏桿菌染色體DNA，以特異性引物進行套式PCR擴增，建立牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法，對奶牛感染布氏桿菌病進行普查和監測，為牛奶制品的食品安全監測提供新的技術手段。建立一種高效準確的布魯氏菌診斷方法，為在實際生產中檢測奶樣中布魯氏菌病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 S2型豬布魯氏菌疫苗株由黑龍江八一農墾大學動物科技學院預防獸醫實驗室保存

1.2 引物 根據GenBank中公布豬型布魯氏菌外膜蛋白 25ku基因序列（GenBank 登錄號為：AM712381），應用Oligo 6.0軟件設計2對引物。由上海生工生物工程有限公司合成。

外部上游OMP1：5’-CGTGCCGCAATACCCTC-3’

外部下游OMP2：5’-CCGTCAGCTTGGCTTCGA-3’

內部上游OMP3：5’-GATGCTGCCCGCCCGATAA-3’

內部下游OMP4：5’-GCACCGAGCGAGCCTTGAAA-3’

2 試驗方法

2.1 細菌培養 在布氏桿菌培養基平板上劃線接種S2型豬布魯氏菌，在37℃保溫箱里放置24 h，挑取單菌落接種到液體培養基，37℃溫箱培養OD600≈0.5。

2.2 細菌計數 取50 μL細菌培養物，以液體培養基進行連續10倍的倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋的菌液各100 μL均勻涂布于瓊脂平板，置37℃溫箱培養24 h，對各稀釋度進行菌落計數。

2.3 布魯氏菌基因組的提取 參照邱昌慶等[5]和杜振昆等[2]報道的方法，應用CTAB/NaCl[6]方法，并在此基礎上加以改進。具體方法如下：取1 mL不同稀釋度的布魯氏菌奶樣于離心管中，10 000 r/ min離心10 min，棄掉上清液，加100 μL NET懸浮沉淀；加入100 μL 24%SDS，置于80℃孵育10 min，冰上冷卻3 min；在邱昌慶的步驟中提到了使用蛋白酶K和RNaseA的終濃度為325 μg/μL和75 μg/μL，分別作用2 h。本研究將蛋白酶K和RNaseA的終濃度都定為800 μg/mL，置于50℃水浴2 h。加入預熱至65℃的CTAB/NaCl 300 μL，置于65℃水浴鍋中10 min。加入600 μL酚-氯仿-異戊醇，顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min，將上清液移入另一離心管中，加入600 μL酚-氯仿-異戊醇，重復操作；在上清液中加入400 μL的異丙醇，混勻，室溫放置5 min，10 000 r/min離心10 min，棄上清液。用1 mL 70%的乙醇洗2次，混勻，l0 000 r/ min離心2 min。加100 μL無菌去離子水，溶解DNA。

2.4 套式PCR擴增體系及循環參數 PCR一擴反應體系。10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板0.5 μL；TAKARA Taq DNA聚合酶0.2 μL；補水至25 μL；循環參數為：PCR反應條件為95℃預變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸10 min。

二擴反應體系采用25 μL反應體系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL；TAKARA Taq DNA聚合酶0.2 μL；補水至25 μL；循環參數為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，20個循環，最后72℃延伸6 min。

2.5 套式PCR條件的優化

2.5.1 退火條件的優化 選擇8個溫度進行優化，分別為46、47.1、47.9、48.8、50.1、51、52.6和54℃，其他條件按上述參數設置，進行套式PCR反應，確定最佳的退火溫度。

2.5.2 dNTP最佳濃度優化 選取dNTP終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6 mm，7個梯度，其他條件不變，進行套式PCR反應，確定最佳的dNTP濃度。

2.5.3 引物濃度的優化 引物的終濃度分別為0.08、0.16、0.24、0.32、0.4、0.48、0.56和0.62 μm，其他條件不變，進行套式PCR反應，確定最佳引物濃度。

2.5.4 Taq DNA聚合酶濃度優化 體系中Taq DNA聚合酶分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3 μL，其他條件不變，進行套式PCR反應，確定最佳的Taq DNA聚合酶濃度。分別取4 μL上樣進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀察擴增結果。

2.5.5 敏感性試驗 對菌液進行細菌計數，確定細菌數為8×106CFU/mL，然后利用奶樣對菌液進行10倍連續稀釋，分別取1 mL進行基因組DNA提取和套式PCR擴增，產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像儀檢測擴增結果。

3 結果

3.1 PCR條件優化結果

3.1.1 退火溫度的優化 最佳退火溫度為50.1℃，結果見圖1。

3.1.2 dNTP濃度優化 dNTP最佳濃度為0.2 mm（2 μL），結果見圖2。

3.1.3 引物濃度優化 引物最佳濃度為各0.4 μM（0.5 μL），結果見圖3。

圖1 退火溫度優化Fig.1 Annealing temperature optimization

圖2 dNTP濃度優化Fig.2 dNTP Concentration optimization

圖3 引物濃度優化Fig.3 Optimization of primer concentration

3.1.4 Taq DNA聚合酶濃度優化 Taq DNA聚合酶最佳濃度為0.1 μL，結果見圖4。

3.2 敏感性試驗結果 應用上述最優的套式PCR方法，最佳退火溫度50.1℃、dNTP最佳濃度為0.2 mm、引物最佳濃度為0.4 μm、Taq DNA聚合酶最佳濃度為0.1 μL，進行的敏感性試驗檢測布魯氏菌的最少菌數為8 CFU/mL，結果見圖5。。

圖4 Taq DNA聚合酶濃度優化Fig.4 Taq DNA Optimization of polymerase concentration

圖5 套式PCR敏感性檢測Fig.5 Nested PCR sensitivity test

4 討論

在布魯氏菌病研究中，用PCR的方法檢測布魯氏菌病始見于1990年，Fekete等[8]最早利用PCR擴增布魯氏菌外膜蛋白基因。1997年首次將PCR應用于中國布病患者的診斷。Bosnakovsk等首次建立了牛乳中布魯氏菌外膜蛋白（OMP）25 Ku套式PCR檢測技術，試驗結果表明，此方法具有較強的特異性，只擴增布魯氏菌DNA。據Lucer報道也有人用其他的布魯氏菌基因區設計引物進行試驗，均能特異性地檢測到布魯氏菌核酸。

鑒于此國內外學者開展了利用PCR方法檢測布魯氏菌的研究。2005年邱昌慶等[7]通過擴增布魯氏菌外膜蛋白建立了套式PCR檢測奶樣中布魯氏菌，其檢測的靈敏度為50 CFU/mL。本研究根據邱昌慶發表的奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術的提取DNA方法的基礎上優化了提取DNA的步驟。在邱昌慶的提取DNA步驟中提到了使用蛋白酶K和RNaseA的終濃度為325 μg/μL和75 μg/μL，分別作用2 h。本研究應用CTAB/NaCl，并且將蛋白酶K和RNaseA的終濃度都定為800 μg/mL，共同作用2 h，提取DNA效果較好，然后對套式PCR條件進行了優化，優化后套式PCR的靈敏度8 CFU/mL，證明本研究建立的方法結果可靠，靈敏度高，節省成本，節省時間。本研究為以后實際生產中檢測奶樣奠定基礎。

參考文獻

[1]Aleixo M J,erreira M L,Antunes F.Brucellosis[J].1999,12(12):323-330.

[2]杜振昆，郭軍慶，張妙仙，等.牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法的建立[J].浙江大學學報，2008，34（2）：169-174.

[3]何明清.畜禽傳染病的防治[M].成都：四川科學技術出版社，1985：167-168.

[4]Mantur B G,Mangalgi S S,Mulimaig B.Burcella melitensis-a sexually transmissible agent [J].Lancet,1996,347:1763.

[5]Ruben B,Band J D,Wong P,et al.Person-toperson tras-mission of burcella melitensis [J].Lancet,1991,337:14-5.

[6]孫耀貴，黃姜生，陳佳.三種血清學方法檢測奶牛布魯氏桿菌病的比較試驗[J].黑龍江畜牧獸醫，2005（1）：42-43.

[7]邱昌慶，曹小安.乳牛布魯氏菌病病原DNA快速檢測技術的研究[J].中國獸醫科技，2005，35（2）：85-89.

[8]Fekete A,Bantle J A,Halling S M,et al.Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction [J].Journal of Applied Bacteriology,1990, 69(2）:216-227.

For detection of Brucella in milk nested PCR methods

Sun Guangye,Zhang Lu,Wang Shanshan,Hou Xilin*
(College of animal science and technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

In order to establish a method for Brucella in milk rapid detection,this study nested PCR method,by optimizing PCR conditions,improved Brucella DNA extraction method,proven,optimal annealing temperature of 50.1℃,best dNTP concentration is 0.2 mM,optimum primer concentration was 0.4 μM,Taq DNA polymerase,the optimal concentration was 0.1 μL,the present method is the minimum number of detected bacteria 8.The results show that by nested PCR method to improve the sensitivity of detection of Brucella in milk.

Brucella;Nested-pcr;Milk sample

S852.61+9

：B

：1672-9692(2016)09-0001-05

2016-07-09

孫光野（1992-），男，碩士研究生，研究方向為動物傳染病診斷。

侯喜林（1965-），男，博士，教授，博士生導師，研究方向為動物傳染病診斷與防治。