白掌根腐病生防菌的篩選與鑒定

陳紅彩，游 杏，丁 當，趙 沖，游春平

（仲愷農業工程學院農學院，廣東 廣州 510225）

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白掌根腐病生防菌的篩選與鑒定

陳紅彩，游 杏，丁 當，趙 沖，游春平

（仲愷農業工程學院農學院，廣東 廣州 510225）

摘 要：采用對峙培養法，從土壤中篩選出對白掌根腐病菌有拮抗作用的2株細菌菌株C3和S1；通過盆栽防治試驗，結果顯示2株拮抗細菌C3和S1對白掌根腐病的防效分別為55%和50%；通過16SrDNA序列分析，拮抗細菌菌株C3和S1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的序列相似性達99%；通過構建系統發育樹，菌株C3與枯草芽孢桿菌在同一分支上，而菌株S1不在同一分支上。因此，初步將拮抗細菌菌株C3和S1分別鑒定為枯草芽孢桿菌和芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

關鍵詞：白掌；根腐病；生防菌；鑒定

近年來，我國花卉種植規模越來越大，產業化水平越來越高，出現了多方位、多層次、多行業發展花卉的新局面。花卉產業已成為重要的農業支柱產業之一。然而，日趨嚴重的土傳病害（如白掌根腐病、紅掌根腐病、蘭花根腐病和疫病等）已成為限制花卉產業發展和花農收入的一個重要因素。高檔盆花是廣東省花卉產業的優勢花卉之一，在“十一五”期間發展迅猛，產值和出口創匯均位列花卉產業之首。國蘭和紅掌均勢廣東主栽的高檔盆花，其中國蘭種植面積達733.3 hm2，占國內國蘭種植面積50%以上；紅掌盆花年產約500萬盆，約占全國紅掌盆花總產量的60%。白掌盆花年產約400萬盆，約占全國白掌盆花總產量的20%。據項目組前期調查，腐爛病是這兩種盆花的重要病害，常造成植株黃化枯萎，發病嚴重的大棚發病率可達30%，給生產和花農收入造成嚴重影響。由于此病為土傳病害，目前生產上主要通過化學農藥處理栽培基質來防治。但是，由于可供使用的化學農藥種類不多，長期反復使用導致病原菌抗藥性增強，藥劑防效降低、使用量增加。目前已有一些生防制劑用于農作物病害的防治，但還沒有開發出用于花卉病害防治的生防制劑，因此開發出用于花卉病害防治的生防制劑具有重要的實現意義。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

BPDA培養基（牛肉膏蛋白胨瓊脂）配方參照龔國淑等的方法［1］；PDA和PD培養基配方參照方中達的方法［2］；白掌根腐病菌（Cyliadroclsdium sp.）由仲愷農業工程學院植物病理實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗細菌篩選 于仲愷農業工程學院校園中選取1 g土樣，加入1 000 mL蒸餾水中。采用劃線稀釋法［3］，在含BPDA平板上進行分離、純化，獲得大量細菌菌株。將細菌菌株與白掌根腐病菌在PDA平板上進行對峙培養，挑選拮抗效果較好的拮抗細菌。

1.2.2 生防菌篩選 在PD培養液中震蕩培養48 h的拮抗細菌噴淋于白掌苗（株高約20 cm）根部，對照為不噴淋拮抗細菌，每個處理3次重復，每個重復15株。培養48 h后再接種白掌根腐病菌（在小麥粒上培養7 d），將處理過的白掌盆栽苗置于28℃溫室中培養，15 d后觀察防治效果。

1.2.3 細菌菌株鑒定 將純化的生防菌株送至上海立菲生物技術有限公司進行16S rDNA序列分析，將病菌16S rDNA序列在GenBank（登錄http://.ncbi.nlm.nih.gov）中進行Blast比對，分析序列相似程度。利用MEGA4.0軟件的Clustal W程序進行精確比對，采用Neighbor-joining法［4］，將GenBank中序列相似度較高的細菌與病原菌構建系統發育樹，分析病原菌的歸屬。

2　結果與分析

2.1 生防菌篩選

從土壤中分離出C1、C2、C3、C4、S1等5個細菌菌株，并與白掌根腐病菌（Cyliadroclsdium sp.）進行對峙培養，結果顯示，菌株C3與菌株S1對白掌根腐病菌生長具有明顯的抑制作用。

在PD培養液中震蕩培養48 h的拮抗細菌噴淋于白掌苗根部，培養48 h后再接種白掌根腐病菌，15 d后觀察拮抗菌防治效果，結果顯示，拮抗菌株C3和S1對白掌根腐病的防治效果分別為55%和50%。

2.2 生防菌株C3和S1的分子鑒定

2.2.1 生防菌株C3的分子鑒定結果 在GenBank上進行16S rDNA序列比對，與該菌株C3的16S rDNA序列（圖1）相似度達99%的細菌均為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或未定種的芽孢桿菌（Bacillus sp.），利用Genestar、DNASP和Mega5軟件構建菌株C3與相關細菌16S rDNA的系統發育樹，結果（圖2）顯示，菌株C3與枯草芽孢桿菌在同一分支上，因此，初步將菌株C3鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.2.2 生防菌株S1的分子鑒定結果 在GenBank上進行16S rDNA序列比對，與該菌株S1的16S rDNA序列（圖3）相似度達99%的細菌有8株枯草芽孢桿菌、1株龍舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）和2株未定種的芽孢桿菌（Bacillus sp.），利用Genestar、DNA-SP和Mega5軟件構建菌株S1與相關細菌16S rDNA的系統發育樹，結果顯示，菌株C3與枯草芽孢桿菌和舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）不在同一個分支（圖4），因此，初步將菌株C3鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

圖1　菌株C3的16S rDNA序列

圖2　病原菌菌株C3與相似種的16S rDNA分子系統發育樹

圖3　菌株S1的16S rDNA序列

圖4　病原菌菌株S1與相似種的16S rDNA分子系統發育樹

3　討論

白掌根腐病是一種土傳病害，這類病害難以防治，包括化學防治措施，而且化學藥劑容易造成環境污染，因此開發環境友好、防效較高的生防制劑具有非常重要的現實意義。本研究獲得對白掌根腐病防效分別為55%和50%的生防菌株C3和S1。關于細菌的鑒定方法，利用16S rDNA擴增測序技術鑒定細菌與其它細菌鑒定方法比較，具有高效、準確、簡便、特異性強的優點，己成為微生物分類學中最重要的方法，但是同一屬內不同種細菌的16S rDNA序列高度保守，有時僅僅根據16S rDNA序列相似性難以進行種水平上的鑒定，現在許多人通過構建系統發育樹，對微生物在種水平上進行鑒定［5-8］。通過16S rDNA序列分析和構建系統發育樹，初步將生防菌株C3和S1鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和芽孢桿菌（Bacillus sp.）?？莶菅挎邨U菌作為生防菌已開發出許多產品，如Kodiak（GB03）、Subtilex（MBI600）、Serenade（QST713）和Taensa（FZB24），我國開發的亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧、康地蕾得等。近年來，國內外對于芽孢桿菌各方面應用的研究日益增多，枯草芽孢桿菌作為一種生防細菌越來越引起人們的關注［9-10］。而經研究發現，芽孢桿菌是土壤和植物微生態區系的優勢生物種群，許多性狀優良的菌株表現出對多種植物病原菌的拮抗抑制作用［11］，對糧食、蔬菜和水果等病害有較好的防治效果［12］。本研究獲得的生防菌株C3和S1在盆栽試驗中具有一定的防治效果，但對于大田防治效果如何還有待進一步試驗。

參考文獻：

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［9］ 程亮，游春平，肖愛萍.拮抗細菌的研究進展［J］.江西農業大學學報，2003，25（5）：732-737.

［10］ 趙新林，趙思峰.枯草芽孢桿菌對植物病害生物防治的作用機理［J］.湖北農業科學，2011，50（15）：3025-3028.

［11］ 李晶，楊謙，趙麗華，等.生防枯草芽孢桿菌B29菌株抗菌物質的初步研究［J］.中國生物工程雜志，2008，28（2）：59-65.

［12］ 黃曦，許蘭蘭，黃榮韶，等.枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進展［J］.生物技術通報，2010 （1）：24-29.

（責任編輯楊賢智）

Screening and identification of biocontrol bacteria against root rot of Spathiphyllum kochii caused by Cylindroclasdium sp.

CHEN Hong-cai， YOU Xing， DING Dang， ZHAO Chong， YOU Chun-ping

（College of Agronomy， Zhongkai University of Engineering and Agriculture， Guangzhou 510225，China）

Key words：Spathiphyllum kochii；root rot disease；biocontrol bacteria；identification

Abstract：Two antagonistic bacterial strains C3 and S1 against the pathogen of root rot of Spathiphyllum kochii were isolated from horticultural soil by using confront culture， their control efficiencies on root rot of S.kochii reached to 55% and 50%， respectively.Based on analysis of 16S rDNA sequences， similarity between strain C3 or S1 and Bacillus subtilis was 99.9%.Through construction of phylogenetic tree between antagonistic strains and their related strains from GenBank， strain C3 and Bacillus subtilis were on the same clade， but strain S1 and B.subtilis were not on a clade， so，antagonistic strain C3 and S1 were preliminarily identified as Bacillus subtilis and Bacillus sp.， respectively.

中圖分類號：S482.2+92

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）01-0089-04

收稿日期：2015-09-21

基金項目：國家大學生創新基金（KK1133065）

作者簡介：陳紅彩（1994-），女，助教，E-mail：370549533@qq.com

通訊作者：游春平（1962-），男，博士，教授，E-mail：1309497194@qq.com