惠州市冬種馬鈴薯卷葉病毒病的發生、鑒定及氣象影響因子研究

陳兆貴，張 蒙，肖軍委，胡成來（.惠州學院生命科學系，廣東 惠州 56007；.廣東九華馬鈴薯產業有限公司，廣東 惠州 56007）

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惠州市冬種馬鈴薯卷葉病毒病的發生、鑒定及氣象影響因子研究

陳兆貴1，張 蒙1，肖軍委2，胡成來2
（1.惠州學院生命科學系，廣東 惠州 516007；2.廣東九華馬鈴薯產業有限公司，廣東 惠州 516007）

摘 要：以惠州冬種馬鈴薯為研究對象，探索不同氣象條件對冬種馬鈴薯卷葉病毒的影響。以田間調查的形式統計了不同時期冬種馬鈴薯卷葉病毒的發病情況，并對馬鈴薯卷葉病毒進行分子鑒定，分析了惠州市冬季氣溫、相對濕度及降水等氣象條件對冬種馬鈴薯卷葉病毒病的影響。結果表明：3次調查馬鈴薯卷葉病毒病的平均發病率依次為2.48%、12.6%、70.18%，呈上升趨勢；分子鑒定結果顯示確為馬鈴薯卷葉病毒的感染；氣象條件對冬種馬鈴薯卷葉病毒的發生有著重要的影響，其中高溫、少雨，相對濕度在70%～80%的氣象條件易造成馬鈴薯卷葉病毒病的發生和傳播。

關鍵詞：馬鈴薯卷葉病毒；氣象條件；影響；RT-PCR

馬鈴薯是是繼水稻、玉米和小麥之后的世界第四大糧食作物，是一種重要的經濟兼糧食作物；我國是世界馬鈴薯生產第一大國，種植面積約460萬hm2，占世界馬鈴薯生產總面積25%；產量約6 000萬t，占世界馬鈴薯總產量的20%［1］。

惠州市地處廣東省東南部，屬亞熱帶季風氣候，北回歸線橫穿中部，日照時間長，熱量豐富，雨量充足，發展冬種馬鈴薯具有得天獨厚的自然優勢［2］，2013年種植面積已達1萬hm2。隨著冬種馬鈴薯種植面積的擴大，馬鈴薯卷葉病毒發病情況已日益嚴重。影響馬鈴薯卷葉病發生和流行因素有許多，主要包括馬鈴薯種薯帶毒、氣象條件和田間管理措施等。氣象條件對馬鈴薯卷葉病毒的發生有著重要的影響。由于廣東省冬季氣溫高、濕度大，蚜蟲飛遷傳播病毒使馬鈴薯卷葉病毒侵染速度更快，再加上冬種馬鈴薯生產中后期受霜凍和陰雨的影響，產量本身就不高。因此，一旦染病往往導致嚴重減產甚至失收［3］。

國內外關于氣象條件對冬種馬鈴薯卷葉病毒影響的研究不多［3-5］。黃新碧等［3］指出，影響廣東冬種馬鈴薯種植的主要氣象因子是1月的低溫霜凍和2月中旬開始的春雨過多，尤其是高溫高濕的天氣。筆者擬通過不同時期冬種馬鈴薯卷葉病毒發病情況的調查，總結出惠州馬鈴薯冬種季節的氣溫、濕度及降水等氣象條件對馬鈴薯卷葉病毒發生的影響，為防控馬鈴薯卷葉病毒病的發生提供依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試馬鈴薯品種費馬瑞它種植于惠州市惠東縣平海鎮大水坑、徑口村、官田村，磜頭村和鐵涌鎮溪美村的馬鈴薯基地，播種時間均為2013年11月。從田間采集疑似感染馬鈴薯卷葉病毒病的植株，同時采集健康植株作為對照，儲存于超低溫冰箱（-86℃左右）中備用。

1.2試驗方法

1.2.1田間調查法 調查地點為惠東縣平海鎮的大水坑、徑口村、磜頭村、官田村和鐵涌鎮溪美村。根據馬鈴薯的生長周期，分別于2014年1月7日、19日，2014年2月17日進行調查。每個種植點隨機抽取3塊田地，采取五點取樣的方法，調查100株馬鈴薯植株，即每個地點共調查300株，統計疑似感染馬鈴薯卷葉病毒病的植株數量。

1.2.2RNA提取及引物設計 采用試劑盒法提取材料的總RNA，通過凝膠電泳檢測RNA提取效果。根據已有的馬鈴薯卷葉病毒的基因序列及其保守序列的報道設計1對引物［6］，P1和P2引物序列分別為5′-ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAG-3′，5′-CTATTTGGGGTTTTGC AAAG-3′，擴增片段長度為627 bp，由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.3反轉錄 （1）變性、退火反應體系（10.0 μL）：dNTP Mixture 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Template RNA 5.0 μL，RNase Free ddH2O 3.0 μL。（2）變性、退火反應程序：變性65℃ 5 min，退火4℃ 15 min。（3）反轉錄反應體系（20.0 μL）：變性、退火后反應液 10.0 μL，5×RT Buffer 4.0 μL，RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor 40 U/μL） 0.5 μL，RNA反轉錄酶（PrimeScriptTM RTase ）1.0 μL，RNase Free ddH2O 4.5 μL。（4）反轉錄反應程序：45℃ 45 min，95℃ 5min，4℃15 min。

1.2.4PCR擴增 （1）PCR反應體系（50.0 μL）：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，特異上游引物0.5 μL，特異下游引物0.5 μL，Taq DNA polynarase 0.5 μL，反轉錄反應液2.0 μL，RNase Free ddH2O 39.5 μL。（2）PCR擴增反應程序：94 ℃預變性1 min；94℃變性30 s， 60℃復性30 s，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸10 min， 4℃ Forever。對PCR擴增產物進行電泳檢測，并測序。

1.2.5馬鈴薯卷葉病毒發生與氣象條件的關系 根據田間調查的時間以及馬鈴薯的生長周期特點，前期以一個月為一個周期，中后期以10 d為一個周期，將這幾個時間段馬鈴薯主產區的氣象條件與馬鈴薯卷葉病毒病的發生情況進行相關性分析。

2　結果與分析

2.1馬鈴薯卷葉病毒發生情況調查

從表1中可以看出，前期調查中，每塊田地只有零星的幾株馬鈴薯感染了卷葉病，第一次調查時發病率均在4%以下；但隨著時間的推移，到中后期馬鈴薯卷葉病迅速蔓延，各田塊的發病率均超過了50%，感病嚴重的田塊發病率甚至高達90%以上。

表1　馬鈴薯卷葉病毒病田間發病情況調查

如圖1所示，采用試劑盒法提取的RNA在電泳時呈現出清晰的3條帶，從上至下依次為28 S rRNA、18 S rRNA、5 S rRNA，說明提取的RNA比較完整，可用于后續試驗。

圖1　RNA電泳檢測結果

2.3RT-PCR擴增結果

如圖2所示，健康植株中提取的RNA未擴增出特異性條帶，而感染了馬鈴薯卷葉病的植株RNA擴增出目的條帶，大小在500 ～750 bp之間，與目標片段627 bp相一致。

圖2　RT-PCR擴增結果

2.4PCR擴增產物測序

PCR 產物由大連寶生物工程有限公司進行純化測序，測序結果為627 bp 片段，與設計的結果一致，擴增的片段序列如下：ATGAGTACGGTCGTGGTTAA AGGAAATGTCAATGGT GGTGTACAACAACCAAGA AGGCGAAGAAGGCAATCCCTTCGCAGGCGCGCTA ACAGAGTTCAGCCAGTGGTTATGGTCACGGCCCC TGGGCAACCCAGGCGCCGAAGACGTAGAAGAGG AGGCAATCGCCGCTCAAGAAGAACTGGAGTTCCC CGAGGACGAGGCTCAAGCGAGACATTCGTGTTTA CAAAGGACAACCTCATGGGCAACTCCCAAGGAA GTTTCACCTTCGGGCCGAGTCTATCAGACTGTCCG GCATTCAAGGATGGAATACTCAAGGCCTACCATGA GTATAAGATCACAAGCATCTTACTTCAGTTCGTCA GCGAGGCCTCTTCCACCTCCTCCGGCTCCATCGCT TATGAGTTGGACCCCCATTGCAAAGTATCATCCCT CCAGTCCTACGTCAACAAGTTCCAAATTACGAAG GGCGGCGCCAAAACTTATCAAGCGCGGATGATAA ACGGGGTAGAATGGCACGATTCTTCTGAGGATCAG TGCCGGATACTGTGGAAGGGAAATGGAAAATCTTC AGATACCGCAGGATCCTTCAGAGTCACCATCAGGG TGGCTTTGCAAAACCCCAAATAG。經序列分析和同源性比較，確認這個序列就是馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因組序列片段。

2.5馬鈴薯卷葉病毒發生與氣象條件的關系

2.5.1馬鈴薯卷葉病毒發生與溫度的關系 從表2中可以看出，2013年12月的平均氣溫為13.8℃，比較穩定；2014年1月1～10日的平均氣溫為15.4℃，氣溫出現了小幅度的上升，一些植株開始患病；接下來兩個時間段的平均溫度分別為12.3、13.6℃，氣溫恢復到12月時的溫度，都保持在13℃左右，比較穩定，發病率較之前稍微有一些上升；而2014年1月31日至2月9日的平均氣溫由之前的12.3℃上升到16.4℃，最高溫度達到22℃左右，之后又大幅度地降溫，平均氣溫只有11℃，最低溫達到了8.7℃，這種短時間內的冷熱交替天氣使得馬鈴薯植株的自身防御能力大大降低，進而導致卷葉病毒病大面積爆發，植株感病率大幅度上升。

2.5.2馬鈴薯卷葉病毒發生與相對濕度的關系 由表2可知，在馬鈴薯生長發育階段，惠州市的空氣相對濕度總體上表現為上升趨勢，但變化并不大，均在70%～85%范圍內，比較較穩定。在田間調查的前期（2014年1月1日），相對濕度為75.1%左右，田間感染馬鈴薯卷葉病毒病的植株非常少，只有零星的幾株；田間調查中期相對濕度維持在78.5%上下，田間的病株增至30～40株，卷葉病發病率小幅度上升到12.6%；而到后期相對濕度達到80%以上，田間的馬鈴薯卷葉病發病率高達90%。由此可知，隨著時間的推移，空氣相對濕度有所提高，而馬鈴薯卷葉病的發病率也有不同程度的上升，表明馬鈴薯卷葉病毒發生與相對濕度之間存在一定相關性。

表2　馬鈴薯生長周期的氣象條件

2.5.3馬鈴薯卷葉病毒發生與降水的關系 如表2所示， 2013年12月惠州地區的降雨相對較多，而其他時間段降雨非常少，有時連續10 d不曾下雨。3次的田間調查發現，前期的總降水量為1.2 mm，田間感病植株只有零星的幾株；中期的降水量僅為0.2 mm，卷葉病發病率有所上升；后期總降水量為1.0 mm，而馬鈴薯卷葉病毒迅速蔓延傳播，發病率高達90%。雖然各段時間的降水量有一些小差異，但近3個月的總降雨量僅為2.2 mm，非常少。因此，干旱少雨的氣象環境對馬鈴薯卷葉病毒病的發生和傳播有一定的影響。

2.5.4馬鈴薯卷葉病毒發生與日照的關系 如表2所示，在調查期間， 以1月11～20，21～30這兩個時間段的日照最強，總幅射分別達到31 920和35 201 W/m2，而2月10～19日，日照總幅射只有13 791 W/m2，比1月大大降低，加之同時期氣溫過低，馬鈴薯生長緩慢也是馬鈴薯卷葉病毒病流行的原因之一。

3　討 論

影響馬鈴薯卷葉病毒病發生與流行的因素很多，如種薯帶毒、栽培管理、氣象條件及蚜蟲的數量等。影響惠州冬種馬鈴薯卷葉病毒病發生的氣象因素包括溫度、降雨量、日照、相對濕度等。賈小琴等［7］研究指出日照和降水條件是引起臨夏地區馬鈴薯病毒病發生的關鍵氣候因子。在惠州冬種季節，降水一直較少，馬鈴薯種植主要通過田間灌水方式保證馬鈴薯正常生長所需。因此，降水與馬鈴薯卷葉病毒病發生之間的關系并不密切。日照和氣溫對馬鈴薯卷葉病毒的發生有重要的影響，如果處于低溫和日照不足的環境，馬鈴薯生長速度減慢，有可能導致馬鈴薯卷葉病毒病的流行。

氣象條件除了直接影響馬鈴薯卷葉病毒的發生以外，還有一個重要的方面是影響蚜蟲的數量。馬鈴薯卷葉病毒主要通過蚜蟲以持續性方式傳播，其中桃蚜是傳播該病毒的主要中間介體。雖然種薯帶毒率影響著田間初始病株的數量，但蚜蟲數量仍是馬鈴薯生長后期發病率的決定性因素。多數蚜蟲適宜生長溫度在14～25℃之間，而馬鈴薯喜陰涼，不耐高溫，25℃以上高溫會降低宿主對病毒的抵抗力，也有利于傳播媒介蚜蟲的繁殖、遷飛和傳病，從而有利于該病蔓延，加重受害程度［7］。惠州地區在1月1～10日氣溫有小幅度回升，1月31日至2月9日氣溫有大幅度提升，均導致后期馬鈴薯卷葉病毒病的大規模發生。雖然伴隨升溫后馬上有降溫，蚜蟲傳播沒有之前迅速，但是馬鈴薯植株本身對這種高低溫的急劇變化也不適應，一方面降低了宿主對病毒的抵抗力，另一方面還可能引發其他病蟲害。

在濕度較大的情況下，植物生長旺盛，蚜蟲對植物的危害相對較小；相對濕度較小時，植物對吸汁性害蟲較為敏感，易發生萎蔫，同樣的蟲口密度，造成的危害相對較大。相對濕度在50%～80%之間時，蚜蟲生長發育良好，當高于90%或低于35%時，不利于蚜蟲生長繁殖［8］。該研究也表明，在田間調查期間，雖然相對濕度總體上呈上升趨勢，但基本維持在70%～85%左右，均在蚜蟲的適宜范圍內，這也為馬鈴薯卷葉病毒病的發生提供了有利的環境。因此，田間的蚜蟲繁殖快，數量大，危害重。

參考文獻：

［1］ 伍壯生，張西露，劉明月. 南方冬作馬鈴薯產業發展與對策建議［J］.辣椒雜志，2010，（4）：41-43.

［2］ 陳兆貴，林于綿，黃 成. 冬種馬鈴薯卷葉病田間調查及RT-PCR檢測技術研究［J］. 湖北農業科學，2010，49（9）：2134-2137.

［3］ 黃新碧，陳朝慶. 利用自然條件和地理優勢發展發展馬鈴薯生長［J］.馬鈴薯雜志，1994，8（4）：235-238.

［4］ 韋劍峰，吳炫柯，韋冬萍，等. 廣西冬種馬鈴薯的氣候條件分析［J］.安徽農學通報，2011，17（23）：155-157.

［5］ 羅森波. 廣州冬種馬鈴薯氣候適宜性分析與區劃［J］. 廣東氣象，1992，（4）：25-27.

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［7］ 賈小琴，劉治國，傅正濤，等. 臨夏地區近43年來的日照時數變化分析［J］. 江蘇農業科學，2013，（2）：354-358.

［8］ 李 慧. 溫濕度降水對蚜蟲發生的影響［J］. 新疆氣象，1989，（6）：25-26.

（責任編輯：成 平）

Occurrence， Identification and Meteorological Influence Factors of Winter-Planting Potato Leaf Roll Virus Disease in Huizhou City

CHEN Zhao-gui1，ZHANG Meng1，XIAO Jun-wei2，HU Cheng-lai2
（1. Huizhou University， Department of Life Sciences， Huizhou 516007， PRC；2. Guangdong Jiuhua Potato Industry Co.，Ltd ， Huizhou 516300， PRC）

Abstract：in order to study the effects of different meteorological conditions on the leaf roll virus of winter-planting potato in Huizhou province. In the form of field survey investigated in different periods of winter-planting potato roll leaf virus incidence， and identified potato leaf roll virus molecular， analyzed the Huizhou City winter air temperature， relative humidity， precipitation and other meteorological conditions effects to winter-planting potato leaf virus disease. The results showed that the average incidence rate of potato leaf roll virus disease was 2.48%， 12.6%， 70.18%， and it was increased in 3 times investigation； the results of molecular identification showed that the infection of potato leaf roll virus was indeed； meteorological conditions have important effects on the occurrence of winter-planting potato leaf roll virus， including high temperature and little rain， the relative humidity in 70%～80% are the meteorological conditions that easy to cause the occurrence and propagation of potato leaf roll virus.

Key words：potato leaf roll virus； meteorological conditions； influence； RT-PCR

中圖分類號：S435.32

文獻標識碼：A

文章編號：1006-060X（2016）03-0065-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.03.021

收稿日期：2016-01-26

基金項目：廣東省教育廳科技創新項目（KJCX0176）；廣東省科技計劃項目（2013B090200023）

作者簡介：陳兆貴（1973-），男，廣西蒙山縣人，教授，主要從事作物遺傳育種研究。