EdCC保護乳小鼠心肌細胞氧化應激所致細胞損傷及凋亡*

蔣　智， 潘裕佳,2， 賈中申,2， 吳玥婷， 李安潔， 韋　方,2**

(1.貴州省人民醫院 心內科， 貴州 貴陽　550002； 2.貴州醫科大學， 貴州 貴陽　550025)

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EdCC保護乳小鼠心肌細胞氧化應激所致細胞損傷及凋亡*

蔣智1， 潘裕佳1,2， 賈中申1,2， 吳玥婷1， 李安潔1， 韋方1,2**

(1.貴州省人民醫院 心內科， 貴州 貴陽550002； 2.貴州醫科大學， 貴州 貴陽550025)

[摘要]目的： 觀察子宮內膜干細胞(EnSCs)來源細胞因子“雞尾酒”(EdCC)對乳小鼠心肌細胞氧化應激損傷和凋亡的保護作用。方法： 乳小鼠心肌細胞分為正常組、對照組和EdCC組，用過氧化氫(H2O2)造成氧化應激，檢測上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性，TUNEL染色檢測細胞凋亡，DCFH-DA檢測細胞內活性氧族(ROS)濃度。結果： EnSCs呈成纖維細胞樣貼壁生長，EdCC蛋白提取效率為每24 h提取 (241.3±32.1)μg/106個細胞；與對照組比較，EdCC組(100 mg/L)上清液LDH活性明顯降低，心肌細胞凋亡率明顯降低，細胞內ROS濃度降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論： EdCC減輕體外培養乳小鼠心肌細胞氧化損傷及凋亡，可能與降低細胞內ROS水平有關。

[關鍵詞]子宮內膜； 干細胞； 細胞因子； 心肌細胞； 活性氧； 凋亡

急性心肌梗死已成為我國最主要的致死原因[1]。早期再灌注治療能明顯縮小梗死面積改善患者預后，但再灌注是一把雙刃劍，再灌注損傷引起缺血心肌的功能障礙和結構損傷進一步加重削弱了再灌注治療的獲益[2]。其中，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)引起的細胞損傷和凋亡是再灌注損傷的重要機制[3]。隨著介入治療的發展，如何防治再灌注損傷保護缺血心肌已成為急性心肌梗死治療中亟待解決的問題[4]。干細胞通過分泌多種細胞因子保護心肌損傷并促進心肌修復，即旁分泌效應[5]。課題組前期研究發現子宮內膜干細胞(endometrial stem cells, EnSCs)通過旁分泌效應減少大鼠心肌梗死面積，保護心肌細胞，改善心梗后心功能[6]。本研究從EnSCs培養液中提取細胞因子“雞尾酒”(EnSCs derived Cytokine Cocktail, EdCC)，推測EdCC具有心肌保護作用，觀察EdCC對過氧化氫(H2O2)誘導心肌細胞損傷和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料與實驗動物

胎牛血清、DMEM/F12培養液、高糖DMEM培養液、含EDTA胰蛋白酶、PBS(HyClone，中國)，Ⅱ型膠原酶(Worthington，美國)，細胞培養瓶(Corning，美國)，Millipore超濾離心管(Millipore，美國)，3% H2O2溶液、多聚甲醛(凱信，中國)，TUNEL試劑盒、DCFH-DA試劑盒(Invitrogen，美國)，兔抗小鼠Troponin I、DyLight 550驢抗兔IgG(Abcam，美國)。新生1～3 d昆明小鼠，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2EnSCs培養

人EnSCs細胞株購自易文賽生物技術有限公司(杭州，中國)。液氮凍存的細胞株用37 ℃水浴快速溶解后用含10%胎牛血清的DMEM/F12細胞培養液洗去凍存液，接種于25 cm2培養瓶，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后更換培養液，以后每3 d換液，生長融合達70%時進行傳代培養。

1.3EdCC制備與儲存

將EnSCs按每25 cm2面積下8×105個細胞種入培養瓶，24 h后用PBS反復洗去含血清培養基，加入每25 cm2面積下加入3 mL無血清DMEM/F12培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后吸出無血清培養液，5 000 r/min離心15 min，棄沉淀取上清，用Millipore超濾離心管截留上清液中分子量>10 kd的蛋白，蛋白定量后-80 ℃冰箱儲存。Millipore超濾技術可將EnSCs上清液蛋白濃縮70～80倍。

1.4心肌細胞分離培養及分組

將乳小鼠心室肌剪碎，反復加消化液(含0.125% EDTA胰酶和0.1% Ⅱ型膠原酶)于37 ℃消化，吸出上層混濁液置于培養液(含10%胎牛血清的高糖DMEM)終止消化，直至消化完全。最后細胞懸液1 000 r/min離心10 min，棄上清，底層細胞加培養液種入培養瓶放入培養箱靜止1.5 h，吸出未貼壁細胞，1 000 r/min離心10 min，用含100 μmol/L BRDU的培養液重懸，按2.5×105細胞/孔種入24孔板，放入培養箱，24 h后換液，72 h后用于實驗。正常組和對照組加無血清DMEM/F12，EdCC組加不同劑量EdCC，30 min后對照組和EdCC組加1 mmol/L H2O2進行氧化應激損傷，6 h后收集培養液檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，細胞用TUNEL染色檢測凋亡，用DCFH-DA檢測細胞內ROS含量[6]。EnSCs的鑒定見文獻[6]。

1.5LDH活性檢測

培養液5 000 r/min離心10 min，取上清用奧林巴斯5400全數字全自動生化儀檢測各組心肌細胞上清液LDH活性。

1.6心肌細胞凋亡率

TUNEL染色和Troponin I熒光染色檢測心肌細胞凋亡率。乳小鼠心肌細胞用4%多聚甲醛溶液固定5 min，0.2% TritonX100穿膜5 min，PBS-T洗3次，5% BSA封閉30 min，加兔抗小鼠Troponin I 4 ℃孵育過夜，PBS-T洗3次，加DyLight 550驢抗兔IgG于室溫孵育2 h，PBS-T洗3次，加預混的TUNEL染液在37 ℃下孵育60 min，PBS洗3次，加1 mg/L Hoechst孵育5 min，PBS洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察，每孔取5個隨機高倍鏡視野拍照，用Image Pro軟件計數Troponin I陽性TUNEL陽性細胞數占Troponin I陽性細胞的比例。

1.7ROS檢測

乳小鼠心肌細胞用PBS洗3次，用含5 μmol/L DCFH-DA培養液于37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察，固定曝光時間、光柵等所有參數，每孔取5個隨機高倍鏡視野拍照，用Image Pro軟件計算熒光強度。

1.8統計學分析

2結果

2.1EnSCs生長形態及EdCC提取效率

EnSCs貼壁生長，大部分為紡錘形，細胞核圓形位于細胞中間(圖1)。EdCC提取效率為每24 h提取(241.3±32.1)μg/106個細胞。

圖1　體外培養EnSCs生長(200×)Fig.1　Morphology of cultured EnSCs in vitro

2.2心肌細胞上清液LDH活性

與正常組比較，H2O2處理6 h后對照組上清液LDH活性明顯升高，與對照組比較，EdCC濃度達50 mg/L時上清液LDH活性明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；EdCC濃度達100 mg/L時LDH活性最低，見圖2。

(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與EdCC 50 mg/L組比較，P<0.05圖2　各組心肌細胞上清液中LDH活性Fig.2　LDH activity in the supernatants of cardiomyocytes

2.3心肌細胞凋亡率

EdCC組(100 mg/L)心肌細胞凋亡率較對照組明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

注：A為心肌細胞TUNEL染色及Troponin I熒光染色(400×)，B為定量分析心肌細胞凋亡率(n=6)；(1)與對照組比較，P<0.01圖3　心肌細胞凋亡Fig.3　EdCC group and control group cardiomyocytes apoptotic ratio

2.4心肌細胞ROS

EdCC組(100 mg/L)熒光強度明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)，提示EdCC降低細胞內ROS，見圖4。

注：A為心肌細胞用DCFH-DA負載后的熒光照片(400×),B為定量分析熒光強度(n=6)；(1)與對照組比較，P<0.01圖4　心肌細胞ROSFig.4　Cardiomyocytes ROS of EdCC group and control group

3討論

EnSCs具有間充質干細胞特性，可從月經血中分離培養，具有無創獲取、增殖速度快、傳代穩定、低免疫原性及無倫理道德問題等優勢，是異體移植“現貨”干細胞產品中極具潛力的種子細胞[7-8]。但直接移植EnSCs有致心律失常、腫瘤形成、血栓栓塞等潛在風險，阻礙了EnSCs的研究和臨床應用[9-11]。本研究首次從EnSCs培養液中提取EdCC，并研究其心肌保護作用，通過體外實驗證明了EdCC能減輕H2O2所致的心肌細胞損傷和凋亡，并降低細胞內ROS水平。

細胞內絕大部分ROS由線粒體生成，通常僅有少量ROS流出線粒體外，抗氧化系統能及時清除ROS，缺血再灌注損傷時線粒體mPTP通道異常開放，導致大量ROS泄漏造成細胞不可逆損傷是導致心肌細胞死亡的重要原因[3]。本研究利用H2O2模擬缺血再灌注的氧化應激損傷，H2O21 mmol/L作用6 h可較穩定的損傷乳小鼠心肌細胞并誘導凋亡[12]。心肌細胞膜損傷后通透性增加，LDH泄漏至細胞外，因此培養液中LDH活性水平與細胞膜損傷程度相關。本研究發現100 mg/L EdCC能最大程度降低培養液中LDH活性，提示EdCC 100 mg/L是體外實驗保護心肌細胞的最佳濃度。缺血再灌注損傷引起的心肌細胞死亡中凋亡約占80%[13]。為明確EdCC對心肌細胞凋亡的作用，本研究聯合Troponin I免疫熒光染色和TUNEL染色排除混雜的成纖維細胞和內皮細胞的影響[6]；本研究結果可靠的證明了EdCC可降低約50%的心肌細胞凋亡。DCFH-DA進入細胞后可被ROS氧化形成有熒光的DCF，因此DCF的熒光強度與細胞內ROS水平正相關。本研究檢測的細胞內ROS包括外源進入細胞內的H2O2和內源線粒體漏出的ROS，EdCC能顯著降低細胞內ROS水平，這提示EdCC可能保護線粒體功能阻斷mPTP開放，也可能提高抗氧化系統清除ROS能力。EnSCs移植可激活心肌ERK1/2、STAT3和AKT促存活信號通路[14]，推測EdCC的心肌細胞保護效應也是通過上述機制產生，有待進一步研究。

綜上所述，EdCC減輕體外培養乳小鼠心肌細胞氧化應激損傷及凋亡，可能與降低細胞內ROS水平有關，該結果為體內實驗進一步研究EdCC對心肌缺血再灌注損傷的保護作用和機制奠定了基礎。

4參考文獻

[1] 陳偉偉, 高潤霖, 劉力生, 等. 《中國心血管病報告2014》概要 [J]. 中國循環雜志, 2015(7): 617-622.

[2] Perricone AJ, Vander Heide RS. Novel therapeutic strategies for ischemic heart disease[J]. Pharmacol Res, 2014(89):36-45.

[3] Brown DI, Griendling KK. Regulation of signal transduction by reactive oxygen species in the cardiovascular system [J]. Circ Res, 2015(3): 531-549.

[4] Hausenloy DJ, Yellon DM. Targeting myocardial reperfusion injury-the search continues [J]. N Engl J Med, 2015 (11): 1073-1075.

[5] Kelkar AA, Butler J, Schelbert EB, et al. Mechanisms contributing to the progression of ischemic and nonischemic dilated cardiomyopathy: possible modulating dffects of paracrine activities of stem cells [J]. J Am Coll Cardiol, 2015 (18): 2038-2047.

[6] Jiang Z, Hu X, Yu H, et al. Human endometrial stem cells confer enhanced myocardial salvage and regeneration by paracrine mechanisms [J]. J Cell Mol Med, 2013 (10): 1247-1260.

[7] Borlongan CV, Kaneko Y, Maki M, et al. Menstrual blood cells display stem cell-like phenotypic markers and exert neuroprotection following transplantation in experimental stroke [J]. Stem Cells Dev, 2010 (4): 439-452.

[8] Massasa EE, Taylor HS. Use of endometrial stem cells in regenerative medicine [J]. Regen Med, 2012(2): 133-135.

[9] Chang MG, Tung L, Sekar RB, et al. Proarrhythmic potential of mesenchymal stem cell transplantation revealed in an in vitro coculture model [J]. Circulation, 2006 (15): 1832-1841.

[10]Jeong JO, Han JW, Kim JM, et al. Malignant tumor formation after transplantation of short-term cultured bone marrow mesenchymal stem cells in experimental myocardial infarction and diabetic neuropathy [J]. Circ Res, 2011(11): 1340-1347.

[11]Gleeson BM, Martin K, Ali MT, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells have innate procoagulant activity and cause microvascular obstruction following intracoronary delivery: amelioration by antithrombin therapy [J]. Stem Cells, 2015(9): 2726-2737.

[12]李月婷, 劉影, 王靜嫻, 等. 過氧化氫對原代心肌細胞及H9c2細胞的損傷作用 [J]. 貴陽醫學院學報, 2012 (3): 225-227.

[13]Anversa P, Cheng W, Liu Y, et al. Apoptosis and myocardial infarction [J]. Basic Res Cardiol, 1998(Suppl 3): 8-12.

[14]方軍, 吳黎明, 陳良龍. RISK信號通路在心肌預處理及后處理中的作用 [J]. 中國病理生理雜志, 2009 (10): 2062-2067.

(2016-01-15收稿，2016-04-30修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

EdCC Protective Effect on Neonatal Cardiomyocytes from Oxidative Stress Induced Injury and Apoptosis

JIANG Zhi1, PAN Yujia1,2, JIA Zhongshen1,2, WU Yueting1, LI Anjie1, WEI Fang1,2

(1.CardiologyDepartment,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China;2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effect of endometrial stem cells (EnSCs) derived from cytokine cocktail (EdCC) on neonatal mouse cardiomyocytes under oxidative stress induced injury and apoptosis. Methods: Neonatal mouse cardiomyocytes were divided into normal group, control group and EdCC group. H2O2 was used to induce oxidative stress. The lactate dehydrogenase (LDH) activity in supernatants was determined to evaluate cell damage, TUNEL staining was used to count apoptotic cells and DCFH-DA was used to measure intracellular reactive oxygen species (ROS) concentration. Results: EnSCs were adherent fibroblast-like cells and the efficiency of EdCC concentration was(241.3±32.1)g/106 cells in every 24 h. As compared with control group, the LDH activity in supernatants greatly reduced in EdCC group (EdCC 100 g/mL) (P<0.01), and also the apoptotic cardiomyocyte ratio (P<0.01) and intracellular ROS concentration (P<0.01), difference was statistical significant. Conclusion: EdCC alleviated oxidative stress induced injury and cell apoptosis in neonatal mouse cardiomyocytes, possibly associated with decreasing intracellular ROS level.

[Key words]endometrium; stem cells; cytokine; cardiomyocytes; reactive oxygen species; apoptosis

*[基金項目]國家自然科學基金地區科學基金資助項目(81460050)； 貴州省科技廳科學技術基金[黔科合J字(2014)2112號]； 貴州省衛生廳科學技術基金(gzwkj2013-1-006)

[中圖分類號]R54

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0520-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.006

**通信作者 E-mail:weifanggzsy@qq.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2156.056.html