下調干擾素誘導蛋白16對人主動脈外膜成纖維細胞凋亡的影響*

肖　燕， 吳　強

(1.貴州醫科大學 內科學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫科大學 附屬人民醫院 心內科， 貴州 貴陽　550002)

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下調干擾素誘導蛋白16對人主動脈外膜成纖維細胞凋亡的影響*

肖燕1， 吳強2**

(1.貴州醫科大學 內科學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學 附屬人民醫院 心內科， 貴州 貴陽550002)

[摘要]目的： 探討下調干擾素誘導蛋白16(IFI16)對人主動脈外膜成纖維細胞(HAAFs)凋亡的影響及機制。方法： 在HAAFs中轉染IFI16小干擾RNA(siRNA)和Control siRNA，分別作為IFI16基因沉默組(Ⅰ組)、陰性對照組(C組)，未經任何干預的HAAFs作為空白組(N組)，用流式細胞儀檢測凋亡，Western blot檢測IFI16、活化凋亡蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)蛋白表達。結果： 與C組和N組相比，Ⅰ組中IFI16蛋白表達減少，細胞凋亡率下降(P<0.05)，伴隨著Cleaved PARP蛋白表達減少。結論： 下調IFI16表達可抑制HAAFs細胞凋亡，其機制可能與下調Cleaved PARP蛋白有關。

[關鍵詞]干擾素誘導蛋白； 成纖維細胞； 細胞； 主動脈； RNA，小干擾； 凋亡

血管外膜成纖維細胞(vascular adventital fibroblast，VAF)的增殖與遷移廣泛參與動脈粥樣硬化等血管增殖性疾病的發生、發展[1]。人干擾素誘導蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是干擾素誘導蛋白p200家族成員之一，具有抗增殖作用[2]。既往研究示在人腦血管成纖維細胞(human brain vascular adventitial fibroblasts,HBVAFs)中，干擾素α能誘導IFI16的表達并抑制HBVAFs的生長，而通過IFI16 siRNA轉染沉默IFI16能促進HBVAFs生長[3]。在原代內皮細胞中，IFI16能通過半胱氨酸蛋白酶-2(caspase-2)和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)途徑啟動細胞的凋亡[4]，而且caspase-3能通過剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白[5]，促進細胞的凋亡。但IFI16對HAAFs凋亡的影響尚未見報道。因此本研究進一步通過IFI16 siRNA技術，抑制IFI16表達，觀察其對HAAFs凋亡的影響，探討其機制是否部分與下調Cleaved-PARP蛋白有關，對防治血管增殖性疾病具有重要的臨床意義。

1材料與方法

1.1材料

原代HAAFs(6120)、成纖維細胞培養基(2301)、胎牛血清(0010)、成纖維細胞生長因子(2352)、青霉素/鏈霉素溶液(0503)購自Sciencell公司，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(04476093001)購自Roche公司，IFI16 siRNA(sc-35633)、Control siRNA(sc-37007)Control siRNA(FITC-conjugated) (sc-36869)及IFI16抗體(sc-8023)購自Santa Cruz公司，Cleaved PARP(#9541)購自Cell Signaling Technology公司，GAPDH抗體(sc-25778)購自北京中杉金橋，Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(559763)購自BD生物科學。

1.2方法

1.2.1分組取3～5 代HAAFs細胞分為3 組，在HAAFs中轉染IFI16小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和Control siRNA，分別作為IFI16基因沉默組(I組)、陰性對照組(C組)，未經任何干預的HAAFs作為空白組(N組)。

1.2.2siRNA轉染按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent說明書操作，在六孔板中，取對數生長期的細胞鋪板，為1.5×105個/孔鋪板，用不含雙抗的成纖維完全培養基培養，待細胞密度達30%～50%時，分別進行IFI16 siRNA、Control siRNA的轉染。添加siRNA轉染復合物干預6 h后，換不含雙抗的成纖維完全培養基繼續培養，使用Control siRNA(FITC-conjugated)檢測轉染效率，大約在80%～90%，每組3 復孔，實驗重復3 次。

1.2.3IFI16、活化凋亡蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Cleaved PARP)蛋白表達Western blot檢測IFI16、Cleaved PARP蛋白表達。按細胞裂解液(RIPA)說明書提取細胞蛋白，應用Protein A280檢測蛋白濃度。加人SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min變性。每孔上樣80 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜轉移蛋白條帶至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗工作液(IFIl6抗體、Cleaved PARP抗體、GAPDH抗體稀釋度分別為1∶200、1∶1 000、1∶500；置4 ℃冷庫搖床過夜；室溫下孵育稀釋的二抗1 h；ECL化學發光。ImageJ軟件分析IFI16、Cleaved PARP與內參條帶的吸光度值之比。

1.2.4HAAFs凋亡率按Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I說明書操作，用無EDTA的胰酶消化細胞，離心，800 r/min，5 min，用預冷的PBS洗細胞2次，離心，800 r/min，5 min(第二次用預冷的PBS洗滌細胞時，放入1.5 mL的EP管中離心)；用1×Binding Buffer 100 μL沿管壁加入于1.5 mL EP管中，輕彈管壁，重懸細胞(配置1 mL的1×Binding Buffer：900 μL的PBS加入100 μL的10×Annexin V Binding Buffer)；每管細胞中加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-ADD；常溫下，避光孵育15 min；每管細胞中加入400 μL的1×Binding Buffer，在1 h內，用流式細胞儀檢測；采用FlowJo軟件進行分析。在細胞凋亡分布圖中，Q2象限代表晚期凋亡及壞死細胞，Q3象限代表早期凋亡細胞，細胞凋亡率(%)=Q2+Q3；Q1象限是壞死細胞，Q4象限是正常細胞。

1.3統計學處理

2結果

2.1HAAFs的凋亡率

N組、C組和Ⅰ組HAAFs凋亡率為(6.49±1.10)%、(7.42±1.51)%和(3.33±0.41)%，與C組、N組比較，Ⅰ組HAAFs凋亡率較低(P<0.05)。見圖1。

2.2IFI16、Cleaved PARP蛋白表達

與C組和N組比較，Ⅰ組IFI16蛋白表達減少(P<0.05)，同時Cleaved PARP蛋白表達量下調(P<0.05)。見圖2。

注：Q2象限代表晚期凋亡及壞死細胞，Q3象限代表早期凋亡細胞，凋亡細胞比例(%)=Q2+Q3；Q1象限是壞死細胞，Q4象限是正常細胞圖1　HAAFs的凋亡情況Fig.1　Apoptosis of HAAFs of 3 groups

注：(1)與C組比較，P<0.05；(2)與N組比較，P<0.05圖2　IFI16、Cleaved PARP蛋白表達Fig.2　Protein expression of IFI16 and Cleaved PARP

3討論

血管壁主要由內皮細胞(vascular endothelial cell,VEC)、平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)以及VAF和細胞外基質組成。既往研究證實，平滑肌細胞的增殖、遷移在血管重構中扮演者重要角色，而VAF僅起支持和營養作用，但近幾年研究顯示VAF在血管重構過程中也發揮著重要作用[6-8]。因此以VAF作為有效干預的靶點，對防治血管增殖性疾病有重要意義。

人IFI16是p200家族人源蛋白成員之一，廣泛參與調節細胞的增殖、遷移、分化及凋亡[2-3]。Xin等發現，在培養正常人前列腺上皮細胞時，當細胞進入衰老過程時，細胞內的內源性IFI16表達量是之前的4倍，但是在3種前列腺癌細胞株中，IFI16呈表達缺失或者異位表達于細胞質狀態。然而在前列腺癌細胞株PC-3中，過表達IFI16能抑制其集落的形成，并產生了細胞衰老相關的形態學變化或者病理生理的改變，如可見衰老樣形態的細胞增多，可見衰老有關的β-半乳糖苷酶的增多及抑制細胞G1/S期轉換，使S細胞比率降低[9]。說明IFI16能調控細胞的衰老。本課題組前期研究也表明IFN-α能誘導VEC中IFI16的表達并促進細胞凋亡，而通過IFI16 siRNA下調IFI16表達可抑制VEC凋亡[10]。因此，在HAAFs中，本研究通過siRNA技術下調IFI16蛋白的表達，觀察其對細胞凋亡的影響，結果表明，下調IFI16的表達，能減少HAAFs細胞的凋亡。

細胞凋亡是由基因控制的、細胞主動性死亡方式，在個體的生長發育、衰老過程中發揮中重要作用。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是細胞凋亡的中心環節，能被細胞表面死亡受體、線粒體、內質網介導的信號轉導途徑激活，引發“瀑布式”蛋白水解級聯反應，誘導細胞凋亡[11]。Caspase-3是Caspase家族中的成員之一，是細胞凋亡的關鍵效應酶，活化后的Caspase-3能裂解DNA修復相關分子，導致細胞凋亡[12]。PARP是一種存在于許多真核細胞中的DNA修復酶。當DNA損傷時能激活PARP，并介導DNA的修復，然而其又是Caspase-3切割底物[5]。在各種理化因子的刺激作用下，細胞中的PARP能被活化的Caspase-3剪切成Cleaved-PARP，從而失去DNA修復功能，導致細胞凋亡[5]。本研究顯示，下調IFI16的表達，能抑制Cleaved PARP蛋白的表達，并減少HAAFs細胞凋亡。說明在HAAFs細胞中，沉默IFI16蛋白可能通過抑制Caspase-3的激活，下調Cleaved-PARP蛋白的表達，抑制細胞的凋亡。

綜上所述，通過IFI16 siRNA技術，下調IFI16蛋白的表達，能抑制HAAFs細胞凋亡，其機制可能部分與下調Cleaved PARP蛋白有關。

4參考文獻

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(2016-01-06收稿，2016-04-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

Downregulating Effect of IFI16 Expression Downregulating on Human Aortic Adventitial Fibroblasts Apoptosis

XIAO Yan1, WU Qiang2

(1.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect and mechanism of silencing interferon-inducible protein 16 (IFI16) on the apoptosis of human aortic adventitial fibroblasts (HAAFs). Methods: The specific small interference RNA(siRNA) and Control siRNA of IFI16 were transfected into HAAFs in vitro instantaneously. HAAFs were divided into three groups, IFI16 siRNA transfection group (I group), negative control group (C group), untreated HAAFs as blank group (N group).Then cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of IFI16, Cleaved PARP were measured by Western Blot. Results: Comparing with group C and N, the protein expression levels and IFI16 were decreased in group I, the cell apoptosis was downregulated(P<0.05), accompanied with decrease of protein expression of Cleaved PARP. Conclusion: Downregulating of IFI16 expression can inhibit HAAFs cell apoptosis, which may be partially related to the downregulating of Cleaved PARP expression.

[Key words]interferon-inducible protein; fibroblasts; cells; aorta; RNA,small interfering; apoptosis

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81260030)； 貴州省科學技術廳，貴州省人民醫院科技聯合基金項目[黔科合LH字(2015)7159號]

[中圖分類號]R541

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0511-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.004

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2111.038.html