沉默干擾素誘導蛋白16對人主動脈外膜成纖維細胞凋亡的影響*

肖　燕， 吳　強

(1.貴州醫科大學 內科學教研室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院人民醫院 心內科， 貴州 貴陽　550002)

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沉默干擾素誘導蛋白16對人主動脈外膜成纖維細胞凋亡的影響*

肖燕1， 吳強2**

(1.貴州醫科大學 內科學教研室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學附屬醫院人民醫院 心內科， 貴州 貴陽550002)

[摘要]目的： 探討沉默干擾素誘導蛋白16(IFI16)表達對人主動脈外膜成纖維細胞(HAAFs)凋亡的影響及其部分機制。方法： 應用IFI16小干擾RAN(siRNA)、Control siRNA轉染HAAFs分別IFI16基因沉默組(IFI16-siRNA組)、陰性對照組(Control-siRNA組)，未經干預的HAAFs作為空白組；用流式細胞儀檢測凋亡，應用Western blot檢測IFI16、細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達。結果： 與Control-siRNA組或空白組相比，IFI16-siRNA組的細胞凋亡率下降，伴隨著IFI16蛋白表達減少，p-ERK1/2水平增高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論： 沉默IFI16表達可減少HAAFs細胞凋亡，其機制可能部分與ERK信號通路有關。

[關鍵詞]干擾素誘導蛋白； 血管外膜成纖維細胞； 凋亡

血管外膜成纖維細胞(vascular adventitial fibroblast，VAF)增殖和凋亡的失衡是血管重構的細胞學基礎[1-2]。血管重構是高血壓等血管增殖性疾病的主要病理生理特點[1-2]。人干擾素誘導蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)是由p200家族中人源蛋白基因IFI16編碼，在細胞生長中起著負性調控作用，對細胞的凋亡起促進作用[3]。本課題組前期研究發現IFI16在人腦血管外膜成纖維細胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)存在基礎表達，通過下調IFI16表達能促進HBVAFs增殖，提示HBVAFs增殖的調控可能部分與IFI16表達有關[4]。但IFI16對HAAFs凋亡的影響尚未見報道。本研究進一步通過IFI16小干擾RNA(siRNA)轉染使IFI16基因沉默從而抑制IFI16表達，觀察其對HAAFs凋亡的影響，探討其可能的機制，為治療血管疾病提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

原代HAAFs(6120)、成纖維細胞培養基(2301)、胎牛血清(0010)、成纖維細胞生長因子(2352)、青霉素/鏈霉素溶液(0503)購自Sciencell公司；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent購自Roche公司；IFI16 siRNA(sc-35633)、Control siRNA(sc-37007)、Control siRNA(FITC-conjugated) (sc-36869)及IFI16抗體(sc-8023)購自Santa Cruz公司；細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)抗體(ab17942)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體(ab47339)購自Abcam公司；GAPDH抗體(sc-25778)購自北京中杉金橋；Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I(559763)購自BD生物科學。

1.2方法

1.2.1人主動脈成纖維細胞(HAAFs)的培養和分組HAAFs的培養按HAAFs說明書的方法進行培養，取3～5 代細胞用于實驗。實驗細胞分為3 組，為IFI16基因沉默組(IFI16-siRNA組)和陰性對照組(Control-siRNA組)以及未經干預的HAAFs組(空白組)。

1.2.2siRNA轉染在六孔板中轉染，取生長狀態好的HAAFs，以1.5×105個/孔鋪板，用不含雙抗的成纖維完全培養基培養，第2天待細胞密度達30 %～50 %時進行siRNA轉染。按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent說明書操作，添加siRNA轉染復合物干預6 h后，換不含雙抗的成纖維完全培養基繼續培養，使用Control siRNA(FITC-conjugated)檢測轉染效率，大約在80 %～90 %之間。每組3 復孔，實驗重復3 次。

1.2.3IFI16、ERK1/2與p-ERK1/2蛋白測定按細胞裂解液(RIPA)說明書提取細胞蛋白。應用Protein A280檢測蛋白濃度。加人SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min變性。每孔上樣80 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜轉移蛋白條帶至PVDF膜。5 %脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入一抗工作液(IFIl6抗體、ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體、GAPDH稀釋度分別為1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶500)，置4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜，室溫下孵育稀釋的二抗1 h，TBST洗膜，ECL化學發光。ImageJ軟件分析IFI16與內參條帶、p-ERK1/2與ERK1/2的吸光度值之比。

1.2.4HAAFs的凋亡按Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit I說明書操作，用流式細胞儀檢測HAAFs的凋亡情況 ，采用細胞凋亡分布圖，Q2象限代表晚期凋亡及壞死細胞，Q3象限表早期凋亡細胞，凋亡細胞比例(%)=Q2+Q3。Q1象限是壞死細胞，Q4象限是正常細胞。采用FlowJo軟件進行分析。

1.3統計學處理

2結果

2.1HAAFs凋亡率

細胞凋亡包括早期凋亡和晚期凋亡。與Control-siRNA組和空白組比較，IFI16-siRNA組的細胞凋亡率減少(P<0.05),見圖1。以上各指標在Control-siRNA組和空白組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2IFI16、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表達

與Control-siRNA組和空白組比較，IFI16-siRNA組IFI16蛋白表達下調(P<0.05)，同時p-ERK1/2蛋白表達量增加(P<0.05)，見圖2。以上指標在Control-siRNA組和空白組間差異無統計學意義。

3討論

VAF是血管外膜的主要細胞，在血管重構中扮演者重要角色，有效地抑制VAF的增殖、遷移以及表型轉化等對防治血管增殖性疾病有重要意義[1]。

注：A為細胞凋亡統計結果，(1)與Control-siRNA組及空白組比較，P<0.05；B為細胞凋亡分布情況，Q2象限代表晚期凋亡及壞死細胞，Q3象限代表早期凋亡細胞，凋亡細胞比例(%)=Q2+Q3；Q1象限是壞死細胞，Q4象限是正常細胞圖1　沉默IFI16表達對HAAFs凋亡的影響Fig.1　Effect of inhibition of IFI16 expression on apoptosis of HAAFs

注：A為統計結果，B為蛋白電泳結果。(1)與Control-siRNA組及空白組比較，P<0.05圖2　IFI16、p-ERK1/2及 ERK1/2蛋白的表達Fig.2　Protein expression of IFI16, p-ERK1/2 and ERK1/2

IFI16在多種上皮細胞，消化道，泌尿生殖道如卵巢、前列腺、乳腺和乳管表達，并發揮著調節細胞增殖、凋亡、衰老以及細胞分化等廣泛的生物學功能[5]。在骨肉瘤和軟骨肉瘤細胞過表達IFI16能抑制細胞增殖[6]。在前列腺癌細胞核過表達IFI16表達能抑制腫瘤增殖，而異位表達IFI16于細胞質則促進癌細胞衰老[7]。在乳腺癌細胞中缺失或減少的IFI16水平是導致腫瘤抑制因子p53活性降低，p53介導的凋亡失調，促使腫瘤發生的原因之一[8]。在衰老的前列腺上皮細胞和老年人成纖維細胞IFI16表達增加，且在衰老的成纖維細胞沉默IFI16后細胞表現出增殖能力[7-8]。本研究結果表明，在HAAFs中沉默IFI16能抑制細胞凋亡。

ERK1/2由相對分子量分別為44 kD和42 kD的ERKl和ERK2組成，能被各種刺激因子磷酸化而激活，并通過與轉錄因子作用，發揮調節細胞增殖、凋亡及分化等生物學功能。激活的ERK1/2能磷酸化轉錄因子c-myc和Sp1，增強轉錄因子c-myc和Sp1與人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子特異性結合，增加轉錄活性，抑制細胞凋亡[9-10]。在腫瘤細胞中，IFI16蛋白能通過c-myc的介導抑制hTERT的轉錄[11]。在正常人細胞中抑制內源性的IFI16表達能增加hTERT的轉錄[11]。細胞凋亡受抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的調控，其中B細胞淋巴瘤/白血病-2 (B-cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)具有抗凋亡作用，Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Assaciated X protein，Bax)和Bcl-2相關凋亡促進因子(Bcl-2 associated death promoter，Bad)具有促凋亡作用，而細胞中Bcl-2/Bax的比值決定細胞是否凋亡。ERK1/2能磷酸化Bad蛋白，從而抑制Bcl-2/Bax異二聚體中的Bax游離，導致Bax同二聚體的形成減少，抑制細胞凋亡[12]。本研究顯示，抑制IFI16的表達，伴隨著p-ERK1/2蛋白的上調，HAAFs細胞凋亡的減少。

綜上所述，通過IFI16小干擾RNA(siRNA)技術，能抑制IFI16蛋白表達，下調HAAFs細胞的凋亡，伴隨著p-ERK1/2蛋白表達量增多，提示IFI16能調控HAAFs細胞的凋亡，其機制可能部分與ERK1/2信號通路有關，但IFI16是否通過ERK1/2/c-myc/hTERT以及ERK1/2/Bad/Bax信號通路調節HAAFs細胞凋亡，仍需進一步研究。

4參考文獻

[1] 邱菊輝,王貴學,羅向東.肌成纖維細胞與血管內再狹窄[J].中華心血管病雜志, 2009(7):663-665.

[2] Tieu BC,Ju X,Lee C,et al.Aortic adventitial flbroblasts participate in angiotensin-induced vascular wall inflammation and remodeling [J].J Vase Res, 2011(3):261-272.

[3] Mazibrada J,De Andrea M,Rittà M,et al.In vivo growth inhibition of head and neck Squamous cell carcinoma by the Interferon-inducible gene IFI16 [J].Cancer Lett, 2010(1):33-43.

[4] 黃晶,宋方,龍向淑,等.α干擾素對人腦血管成纖維細胞增殖、凋亡與遷移的影響[J].臨床心血管病雜志, 2013(29):952-955.

[5] Liao JC,Lam R,Brazda V,et al.Interferon-inducible protein 16:insight into the interaction with tumor suppressor p53 [J].Structure, 2011(3):418-29.

[6] Zhang Y,Howell RD,Alfonso DT,et al.IFI16 inhibits tumorigenicity and cell proliferation of bone and cartilage tumor cells [J].Front Biosci, 2007(12):4855-4463.

[7] Xin H,Curry J,Johnstone RW,et al.Role of IFI16,a member of the interferon-inducible p200-protein family,in prostate epithelial cellular senescence [J].Oncogene, 2003(31):4831-4840.

[8] Xin D,Larissa P,Sudhakar V,et al.IFI16 Induction by Glucose Restriction in Human Fibroblasts Contributes to Autophagy through Activation of the ATM/AMPK/p53 Pathway [J].PLoS One, 2011(5):e19532.

[9] Dasgupta P,Sengupta SB.Role of diallyl disulfide-mediated cleavage of c-Myc and Sp-1 in the regulation of telomerase activity in human lymphoma cell line U937 [J].Nutrition, 2015 (7-8):1031-1037.

[10]Zhao Q,Assimopoulou AN,Klauck SM.Inhibition of c-MYC with involvement of ERK/JNK/MAPK and AKT pathways as a novel mechanism for shikonin and its derivatives in killing leukemia cells [J].Oncotarget, 2015(36):38934-38951.

[11] Song LL,Ponomareva L,Shen H,et al.Interferon-inducible IFI16,a negative regulator of cell growth,down-regulates expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene [J].PLoS One, 2010(1):e8569.

[12] Quoyer J,Longuet C,Broca C，et al.GLP-1 mediates antiapoptotic effect by phosphorylating Bad through a beta-arrestin 1-mediated ERK1/2 activation in pancreatic beta-cells [J].J Biol Chem, 2010(3):1989-2002.

(2016-02-25收稿，2016-04-28修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 趙毅

Reducing Effect of IFI16 Expression on Human Aortic Adventitial Fibroblasts Apoptosis

XIAO Yan1, WU Qiang2

(1.DepartmentofInternalMedicine,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincePeople'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedcialUniversity,Guiyang550002,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of silencing interferon-inducible protein 16(IFI16) expression on the apoptosis of human aortic adventitial fibroblasts(HAAFs). Methods: The specific small interference RNAs (siRNAs) of IFI16 and Control siRNA were transected into HAAFs in IFI16-siRNA group, negative control group and untreated blank group. Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein levels of IFI16, extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK1/2) were measured by Western Blot. Results: The protein expression levels of IFI16 were decreased in the HAAFs, the cell apoptosis was downregulated, the protein expression levels of p-ERK1/2 were increased, differences were statistic significant (P<0.05). Conclusion: Inhibition of IFI16 expression can downregulate HAAFs cell apoptosis, which may be related to the ERK signaling pathway.

[Key words]interferon-inducible protein; human aortic adventitial fibroblasts; apoptosis

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81260030)； 貴州省科學技術廳-貴州省人民醫院科技聯合基金項目[黔科合LH字(2015)7159號]

[中圖分類號]R541

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0507-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.003

**通信作者 E-mail:gzgywq@126.com

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2037.020.html