HDAC2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌ovcar3細(xì)胞中p53和乙酰化p53k320表達(dá)的影響>*

張　敏，趙書君，朱　海，胡曉靜，余亞南，韓會(huì)會(huì)，曹　蒙，李紅雨

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

HDAC2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌ovcar3細(xì)胞中p53和乙?；痯53k320表達(dá)的影響>*

張敏，趙書君，朱海，胡曉靜，余亞南，韓會(huì)會(huì)，曹蒙，李紅雨#

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞組蛋白去乙酰化酶2；p53；乙酰化p53k320；ovcar3細(xì)胞株；卵巢腫瘤

摘要目的：探討靶向沉默組蛋白去乙?；?(HDAC2)對(duì)人卵巢癌ovcar3細(xì)胞中p53乙?；稽c(diǎn)k320表達(dá)的影響。方法：將ovcar3細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組3組，實(shí)驗(yàn)組以HDAC2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA，空白組不處理，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)3組細(xì)胞中HDAC2 mRNA和蛋白的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)3組細(xì)胞中p53、乙?；痯53k320蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與空白組及對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HDAC2 mRNA和蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)，p53蛋白和乙?；痯53k320蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。結(jié)論：下調(diào)HDAC2的表達(dá)可使p53和乙酰化p53k320表達(dá)增加。

卵巢上皮性癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其病死率位居第1，由于起病比較隱匿，臨床缺乏早期診斷方法，大約70% 以上的卵巢上皮性癌患者就診時(shí)已屬晚期，其5 a 生存率僅30%～40%[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)表觀遺傳能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其涉及染色質(zhì)層面，主要為核心組蛋白共價(jià)修飾(組蛋白修飾)[3]。組蛋白乙?；癄顟B(tài)由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)之間的活性競(jìng)爭(zhēng)決定[4-5]。HDAC2作為組蛋白去乙?；讣易逯械囊粏T，廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄沉默[3]。組蛋白去乙?；梢鹨职┗蛉鏿53等的表達(dá)被抑制或過度激活，均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6]。p53和HDAC2之間的關(guān)系密切，其活性可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)控，例如乙?；饔肹7]。 p53功能被HDAC2通過泛素化依賴識(shí)別和伴隨p53在k320位點(diǎn)的脫乙?；卓筟8]。k320位于p53與DNA連接的四聚化結(jié)構(gòu)域，通過減少p53k320乙?；鸬娘@性負(fù)效應(yīng)可能會(huì)損害p53四聚體結(jié)構(gòu)域，從而影響p53與DNA的結(jié)合，影響靶基因的表達(dá)。作者擬采用RNA干擾技術(shù)，通過構(gòu)建針對(duì)HDAC2基因的siRNA，特異性降低HDAC2的表達(dá)，觀察其對(duì)卵巢癌ovcar3細(xì)胞中p53k320表達(dá)的影響，為卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器ovcar3細(xì)胞由鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院科研中心保存。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司，逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測(cè)試劑盒購自中國南京諾唯贊生物科技有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，GAPDH、HDAC2、PCR引物及HDAC2 siRNA購自美國GeneCopoeia公司，HDAC2、p53、乙?；痯53k320抗體購自無錫藥科美生物科技有限公司。紫外可見光分光光度計(jì)為美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ovcar3細(xì)胞，48 h后傳代培養(yǎng)備用。轉(zhuǎn)染前1 d更換體積分?jǐn)?shù)1% FBS培養(yǎng)基同步化處理細(xì)胞12 h，依次接種于新的直徑6 cm培養(yǎng)皿中，用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞均勻、完全貼壁生長(zhǎng)后且細(xì)胞密度大于80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞50%～70%融合時(shí)，分為3 組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組更換為新鮮配制的含 HDAC2 siRNA 或?qū)φ誷iRNA 的無抗生素、無血清培養(yǎng)基，空白組僅加入同種培養(yǎng)基。孵育6 h 后加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照美國GeneCopoeia公司siRNA說明書進(jìn)行操作，每組加入FBS、含有青霉素和鏈霉素的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基，用EndoFectin(美國GeneCopoeia公司)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下轉(zhuǎn)染8～14 h，48 h后采用熒光顯微鏡觀察各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.3HDAC2 mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)按Trizol試劑盒操作說明提取細(xì)胞總RNA。按試劑盒操作程序，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA后5倍稀釋，取1 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。按說明書配制PCR反應(yīng)體系。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，退火20 s，72 ℃延伸15 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，立即進(jìn)行熔解曲線分析。每組均設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組細(xì)胞中HDAC2 mRNA、蛋白及p53、乙?；痯53k320蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組卵巢癌ovcar3細(xì)胞中HDAC2 mRNA及蛋白的表達(dá)見圖1、表1。

圖1　3組卵巢癌ovcar3細(xì)胞中HDAC2蛋白的表達(dá)

組別nHDAC2mRNAHDAC2蛋白空白組31.035±0.1870.959±0.093對(duì)照組30.996±0.1520.921±0.105實(shí)驗(yàn)組30.258±0.063*0.450±0.062*F92.186102.430P<0.001<0.001

*：與空白組和對(duì)照組相比，P<0.05。

2.23組卵巢癌ovcar3細(xì)胞中p53、乙?；痯53k320蛋白的表達(dá)見圖2、表2。

圖2　3組卵巢癌ovcar3細(xì)胞中p53及乙酰化p53k320蛋白的表達(dá)

表2　3組卵巢癌ovcar3

*：與空白組和對(duì)照組相比，P<0.05。

3討論

作者根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成了針對(duì)HDAC2基因干擾位點(diǎn)的2條siRNA，經(jīng)過沉默效率的比較，選用其中有意義的1條siRNA，用于轉(zhuǎn)染至ovcar3細(xì)胞后進(jìn)行基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，siRNA能有效地阻抑HDAC2 mRNA的表達(dá)。

HDAC2為HDACs家族成員，HDACs可以移去N 端的乙?；?，減弱DNA 和組蛋白的相互作用而抑制轉(zhuǎn)錄[7]。有研究[9]證明，泛素化的HDAC2作用于乙?；膒53k320可使后者去乙?；?，致使p53與DNA結(jié)合能力下降，從而影響靶基因的表達(dá)。因此作者采用沉默HDAC2基因，降低HDAC2的表達(dá)，觀察對(duì)乙?；痯53k320表達(dá)的影響。結(jié)果表明，沉默HDAC2基因可降低HDAC2 mRNA和蛋白的表達(dá)，使p53表達(dá)增加，乙?；痯53k320表達(dá)也增加。作者的研究不能肯定下調(diào)HDAC2的表達(dá)可上調(diào)p53k320的乙酰化水平，考慮可能還存在其他乙?；緩交蚍且阴；緩接绊慔DAC2對(duì)乙?；痯53k320的表達(dá)。

作者的研究結(jié)果從細(xì)胞分子水平證實(shí)HDAC2 的表達(dá)對(duì)ovcar3細(xì)胞中p53的表達(dá)具有調(diào)控作用，靶向沉默HDAC2 的表達(dá)可上調(diào)ovcar3細(xì)胞中p53的表達(dá)，提示其在卵巢癌的形成過程中起重要作用，并可能成為新的抗癌藥物的靶點(diǎn)。由于卵巢癌的發(fā)生發(fā)展因素多種多樣，目前只是進(jìn)行初步研究HDAC2對(duì)ovcar3細(xì)胞中p53表達(dá)的影響，至于HDAC2對(duì)p53的影響途徑，后期將進(jìn)一步研究。

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(2015-08-06收稿責(zé)任編輯趙秋民)

Effect of HDAC2 siRNA transfection on expression of p53 and acetylated p53k320 in ovarian cancer ovcar3 cells

ZHANGMin,ZHAOShujun,ZHUHai,HUXiaojing,YUYanan,HANHuihui,CAOMeng,LIHongyu

DepartmentofGynecologyandObstetrics，theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordshistone deacetylase 2;p53;acetylated p53k320;ovcar3 cells line;ovarian neoplasm

AbstractAim: To investigate the effect of targeted silencing histone deacetylase 2(HDAC2) on expression of p53 and acetylation p53k320 in human ovarian cancer cell line ovcar3. Methods: ovcar3 cells were divided into 3 groups. HDAC2 siRNA was used to transfected into the ovcar3 cells in experimental group, and the cells transfected with control siRNA(control siRNA group) and the cells without treatment(control group) were the control. Real Time-PCR and Western blot was used to detect the expression of HDAC2 mRNA and protein; the expression of p53 and acethylased p53k320 were examined by Western blot.Results: Compared with control group and control siRNA group,the expressions of HDAC2 mRNA and protein in experimental group were decreased(P<0.05), and the expressions of p53 and acethylased p53k320 protein were increased(P<0.05).Conclusion: Downregulating the expression of HDAC2 could increase the expressions of p53 and acethylased p53k320.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.022

#通信作者，女，1964年9月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤，E-mail：lihongyu99@qq.com

中圖分類號(hào)R737.31

*鄭州市科學(xué)技術(shù)局2015普通科研項(xiàng)目153PKJGG165