脂肪源間充質干細胞移植對D-半乳糖衰老模型大鼠腎、肺組織中衰老相關蛋白表達的影響>*

崔淵博，馬珊珊，張春艷，姚　寧，渠瑞娜，范天黎，關方霞#

1)鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心 鄭州 450007　2)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001　3)鄭州大學附屬鄭州中心醫院檢驗科 鄭州 450007　4)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001

脂肪源間充質干細胞移植對D-半乳糖衰老模型大鼠腎、肺組織中衰老相關蛋白表達的影響>*

崔淵博1)，馬珊珊2)，張春艷3)，姚寧2)，渠瑞娜2)，范天黎4)#，關方霞2)#

1)鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心 鄭州 4500072)鄭州大學生命科學學院 鄭州 4500013)鄭州大學附屬鄭州中心醫院檢驗科 鄭州 4500074)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001

關鍵詞間充質干細胞移植；衰老模型；衰老相關基因；大鼠

摘要目的：探討脂肪源間充質干細胞(ADMSCs)靜脈移植對D-半乳糖衰老模型大鼠的抗衰老效果。方法：18只SD大鼠隨機平均分為3組，模型組與移植組大鼠連續8周腹腔注射D-半乳糖[100 mg/(kg·d)]，對照組腹腔注射生理鹽水。然后移植組尾靜脈注射ADMSCs(4×106個)，模型組和對照組尾靜脈注射生理鹽水。4周后，采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力，并測定大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性，并用Western blot法檢測大鼠腎與肺組織中衰老相關蛋白沉默信息調節因子1(Sitr1)、P16、P21及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達。結果：與對照組相比，模型組大鼠空間學習記憶能力降低(P<0.05)；與模型組相比，移植組大鼠空間學習記憶能力明顯改善(P<0.05)。與對照組相比，模型組大鼠血清中SOD活性降低，腎與肺組織中Sirt1、PCNA蛋白表達水平降低(P<0.05)，P21、P16蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組相比，移植組大鼠血清中SOD活性增加(P<0.05)，腎與肺組織中Sirt1、PCNA蛋白表達水平升高(P<0.05)，P21、P16蛋白表達水平降低(P<0.05)。結論：ADMSCs靜脈移植治療抗衰老作用明顯，其可能通過調節衰老相關蛋白表達發揮作用。

衰老作為生物個體一種必然發生的生命現象，是一個動態的、復雜的過程，整體表現為代謝能力下降、適應能力減退等。目前，延緩衰老已成為生命科學及醫學領域研究的熱點。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新能力強、分化潛能多向等特點，近年來被越來越多地應用于再生醫學領域，其在治療諸如神經系統損傷疾病、心血管疾病等多種衰老相關疑難雜癥方面取得了良好的效果[1-2]。研究發現，應用MSCs移植治療阿爾茨海默病轉基因模型鼠能夠促進成體腦部神經再生及改善病理性損害[3]；采用干細胞移植治療能夠顯著改善糖尿病、骨質疏松癥等衰老相關疾病模型大鼠的癥狀[4-5]；但治療機制仍不明確。機體的生理病理過程均受基因的調控，多種基因與衰老的進程關系密切[6]。該研究采用D-半乳糖誘導方法建立大鼠衰老模型，選擇具有體外增殖率高、衰老比率較低、獲取來源廣泛、無倫理學爭議等優點的脂肪源間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)進行移植，在行為功能學、生化與分子生物學水平觀察了ADMSCs移植的抗衰老效果，并探討可能的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器18只3月齡清潔級健康雄性SD大鼠(體重200～240 g)購自河南省實驗動物中心，大鼠ADMSCs由課題組前期分離培養并經過流式細胞術表型鑒定[7]后獲得，凍存、復蘇并傳代后用于實驗。細胞DMEM培養基、無噬菌體胎牛血清、胰蛋白酶消化液、堿性成纖維細胞生長因子等購自康為世紀生物公司，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、ECL發光試劑盒、羊抗兔二抗、β-actin、沉默信息調節因子1(Sitr1)、P16、P21及增殖細胞核抗原(PCNA)兔抗鼠一抗等購自Sigma公司，垂直電泳槽、轉膜儀等購自伯樂生物醫學產品有限公司。

1.2實驗分組18只大鼠隨機均分為3組。模型組與移植組腹腔注射D-半乳糖[劑量為100 mg/(kg·d)，連續注射8周[8]]以誘導制備大鼠衰老模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水。然后取第3代ADMSCs用DMEM培養基制備成2×106mL-1的單細胞懸液。移植組大鼠尾靜脈注射單細胞懸液2 mL以進行ADMSCs移植，模型組和對照組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3大鼠空間學習記憶能力的檢測ADMSCs移植后4周，采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力。水迷宮分4個象限，直徑為200 cm，高度為60 cm；平臺直徑為18 cm，高度為30 cm，置于水迷宮的第1象限；水迷宮中水面高度以剛沒過平臺為宜，水溫控制在(25±1) ℃。實驗前1周為空間適應性練習階段，大鼠每天在固定時間段內入水進行2～3次練習。適應性練習結束，即開始正式實驗。整個水迷宮實驗階段需保持周圍環境不變。①空間探索實驗：將大鼠依次從水迷宮4個不同象限放入水池，利用采集器采集大鼠運動軌跡，觀察并記錄穿越平臺次數、逃避潛伏期、平臺所在象限的停留時間。②反向探索實驗：將平臺位置對調置于第4象限，實驗方法同上，將大鼠依次從水迷宮4個不同象限放入水池，觀察并記錄上述3個指標。

1.4大鼠血清中SOD活性的測定Morris水迷宮實驗后，斷頸處死大鼠，采集1.5 mL外周血于潔凈的2 mL EP管中，3 500 r/min離心10 min，收集上清于-20 ℃保存備用。按照Sigma公司SOD活性檢測試劑盒說明書操作，測定血清中SOD活性。

1.5大鼠腎、肺組織中衰老相關蛋白的檢測分離大鼠的腎、肺組織，提取蛋白并測定蛋白濃度。各取200 μg總蛋白并加入上樣緩沖液，沸水浴中處理約10 min，冷卻至室溫后于-20 ℃保存備用。每個蛋白樣品依次經SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜，加β-actin、Sitr1、P16、P21及PCNA抗體雜交，ECL發光檢測，膠片晾干后用掃描儀掃描，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。以模型組或移植組與對照組蛋白表達水平的比值表示其蛋白相對表達水平。

1.6統計學處理采用SPSS 19.0分析數據。采用單因素方差分析比較3組大鼠空間學習記憶能力、血清中SOD活性,模型組和移植組腎、肺組織中衰老相關蛋白相對表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組大鼠空間學習記憶能力的比較3組大鼠在實驗過程中沒有出現死亡，進食正常，無煩躁等情緒波動。與對照組相比，模型組大鼠穿越平臺次數減少，逃避潛伏期延長，平臺所在象限的停留時間縮短；與模型組相比，移植組大鼠穿越平臺次數增加，逃避潛伏期縮短，平臺所在象限的停留時間延長(P均<0.05)。見表1。

表1　3組大鼠水迷宮實驗結果

*:與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠血清中SOD活性的比較對照組、模型組和移植組大鼠血清中SOD活性分別為(112.04±7.53)、(79.36±5.28)、(103.72±6.95) U/mL，3組比較差異有統計學意義(F=39.071，P<0.001)。與對照組相比，模型組大鼠血清中SOD活性降低；與模型組相比，移植組大鼠血清中SOD活性明顯升高(P<0.05)。

2.3模型組和移植組大鼠腎和肺組織中衰老相關蛋白相對表達水平的比較見圖1、表2和表3。與模型組相比，移植組大鼠腎與肺組織中Sirt1、PCNA蛋白的表達升高，P16、P21蛋白的表達降低(P均<0.05)。

圖1　3組大鼠腎(上圖)和肺(下圖)組織中衰老相關蛋白的表達

表2　3組大鼠腎組織中衰老相關蛋白表達水平的比較

表3　3組大鼠肺組織中衰老相關蛋白表達水平的比較

3討論

細胞衰老作為一種受遺傳基因控制的、任何生物體必然發生的生命現象，其過程與發生機制十分復雜。關于細胞衰老的理論有多種，主要包括自由基理論、端粒酶學說、程序化衰老理論、代謝學說等[9-11]，但是，迄今仍然沒有一種學說能夠完整地闡釋衰老發生的機制。

ADMSCs是一種來自于機體的多能干細胞，具有取材廣泛、免疫原性低、增殖能力強等特點[12]。因其還具有強大的自我更新能力與多向分化能力等優點，近年來被科研人員應用于糖尿病、骨質疏松癥以及帕金森綜合征等衰老相關疾病等的治療，顯著的治療效果與研究進展為將干細胞應用于抗衰老的研究帶來了新的契機。

近年來，分子生物學研究[13]發現，一些基因與衰老的發生關系密切，衰老細胞的細胞周期將停滯于G期而不能進入S期。P16與P21基因的激活影響了細胞周期而最終引起細胞衰老。有研究[14]顯示，高表達P16可抑制HEK293細胞增殖并將細胞周期阻滯在G0/G1期，促進衰老的發生。Sirt1是一種長壽基因，該基因的缺失將導致機體早衰的發生，其參與了大量與衰老相關的生理病理過程[15]。PCNA在DNA復制和細胞增殖中發揮作用，衰老細胞呈現PCNA低表達現象[16]。

D-半乳糖誘導衰老大鼠模型具有復制方法簡便、易操作、穩定性強等優點，可以較好地模擬肝臟、腎臟、肺等臟器損傷，已被廣泛應用于研究衰老機制以及延緩衰老藥物的篩選等方面。該研究對D-半乳糖衰老模型大鼠通過尾靜脈注射移植ADMSCs，結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠空間學習記憶能力降低，血清中SOD活性降低，腎與肺組織中Sirt1和PCNA表達降低，而P21和P16蛋白表達明顯增強，說明模型組大鼠具有衰老表現。與模型組相比，移植組大鼠空間學習記憶能力提高，血清中衰老相關指標SOD活性顯著升高，提示移植ADMSCs具有抗衰老作用；與模型組相比，移植組大鼠腎與肺組織中Sirt1、PCNA表達升高，而P16、P21表達降低，提示ADMSCs延緩衰老的機制可能是通過調節細胞周期通路實現的。

總之，該研究結果表明，ADMSCs通過調控衰老相關基因而影響衰老的進程。該研究將為從衰老相關基因角度探索衰老發生的機制及尋求延緩衰老的有效方法提供依據。

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Effects of adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation on expression of aging related proteins in kidney and lung tissue of D-galactose induced aging rats

CUIYuanbo1)，MAShanshan2)，ZHANGChunyan3)，YAONing2)，QURuina2)，FANTianli4)，GUANFangxia2)

1)TranslationalMedicineCenter，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500072)SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500013)LaboratoryDepartment,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500074)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Key wordsMSCs transplantation;aging model;aging related gene;rat

AbstractAim: To investigate the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs) transplantation on aging in rats.Methods: A total of 18 SD rats were randomly allocated into three groups. The rats in model group and transplantation group were induced by D-galactose for 8 weeks,and control group were only injected with normal saline. And then, the transplantation group was injected with ADMSCs suspension(4×106) by tail venous pathway, the model and control groups were injected with normal saline of the same quantity. Four weeks later,the spatial learning and memory ability of rats were detected by Morris water maze test,the serum activity of SOD was measured, and the expressions of age-related proteins in kidney and lung tissue were detected by Western blot, including silence information regulator 1(Sirt1), proliferating cell nuclear antigen(PCNA), P16 and P21.Results: Compared with control group, spatial learning and memory ability of rats in the model group reduced(P<0.05),while that in transplantation group was improved compared with the model group(P<0.05).Compared with control group, SOD activity in serum of rats in the model group significantly reduced(P<0.05), Sirt1 and PCNA expressions in kidney and lung tissue dramatically decreased(P<0.05),while P16 and P21 expressions increased(P<0.05). Compared with the model group, SOD activity in serum of rats in tranplantation group increased(P<0.05),Sirt1 and PCNA expressions increased(P<0.05),and P16 and P21 expressions decreased(P<0.05).Conclusion: ADMSCs transplantation has obviously anti-aging effect.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.014

#通信作者:范天黎，女，1969年8月生，博士，副教授，研究方向:腫瘤藥理及抗腫瘤藥物的靶向治療，E-mail:fantianlipp@163.com;關方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干細胞與再生醫學，E-mail:guanfangxia@126.com

中圖分類號R592

*國家自然科學基金資助項目81471306