低能激光照射對大鼠心肌梗死后miRNA-21表達(dá)的影響>*

馬　超，法憲恩，柳　兵，周玉陽，黃真鋒，余海彬

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管外科 鄭州 450014

低能激光照射對大鼠心肌梗死后miRNA-21表達(dá)的影響>*

馬超，法憲恩#，柳兵，周玉陽，黃真鋒，余海彬

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管外科 鄭州 450014

關(guān)鍵詞低能激光照射；大鼠；心肌梗死；miRNA-21；心肌保護(hù)

摘要目的：觀察低能激光照射(LLLI)對大鼠心肌梗死區(qū)及其邊緣組織中miRNA(簡稱miR)-21表達(dá)的影響。方法：將110只SD大鼠分為假手術(shù)組(30只)、對照組(40只)和治療組(40只)。對照組和治療組通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型，假手術(shù)組同部位只穿線不結(jié)扎，3周后治療組采用LLLI處理梗死區(qū)域，對照組和假手術(shù)組照射同一區(qū)域但治療儀不接通電源，各組分別于照射后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d取梗死及邊緣組織，采用RT-PCR法檢測miR-21的表達(dá)。結(jié)果：梗死中心和邊緣區(qū)比較，不同組別之間miR-21表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，處理后不同時間miR-21表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；治療組梗死區(qū)miR-21的表達(dá)在LLLI處理后各時間點(diǎn)的表達(dá)量均高于對照組(P<0.05)；治療組梗死邊緣miR-21的表達(dá)量在48 h達(dá)到峰值，且不同時間點(diǎn)的表達(dá)量均高于對照組和假手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)論：LLLI處理梗死心肌能有效上調(diào)梗死及邊緣區(qū)域miR-21的表達(dá)，有較好的心肌保護(hù)作用。

低能激光照射(low-level laser irradiation，LLLI)在生命科學(xué)領(lǐng)域已有60多年歷史[1]，是一項(xiàng)比較成熟的物理療法。此療法是使用輸出功率為毫瓦級的低能量在未損傷組織的情況下，對靶組織進(jìn)行調(diào)節(jié)、活化等生物學(xué)刺激，以促進(jìn)傷口愈合、降低炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)線粒體代謝、加速ATP的合成、改善細(xì)胞增殖等。近些年，Yang等[2]研究表明LLLI可以增加大鼠心肌梗死后左心室室壁厚度，減少心肌中膠原纖維組織生成，改善心室重塑過程。有學(xué)者[1]指出LLLI可以改善梗死區(qū)組織微環(huán)境，減小心肌梗死面積。該實(shí)驗(yàn)使用低能激光處理大鼠心臟梗死區(qū)，觀察心肌組織中miRNA(簡稱miR)-21的表達(dá)，探討LLLI處理對心肌組織的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料成年雌性SD大鼠110只，體重220～250 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有的動物實(shí)驗(yàn)均得到鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物委員會的批準(zhǔn)。主要試劑、儀器：生物信號采集與分析系統(tǒng)BL-420S型、小動物呼吸機(jī)HX-100E型(成都泰盟科技有限公司)；超聲心動圖機(jī)Sonos 5500型(荷蘭Philips公司)；激光治療儀TY-1型(北京天佑科儀科技有限公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；冷凍離心機(jī)2-16K型(德國Sigma公司)；7500 Fast RT-PCR System(美國Applied Biosystems公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組(30只)、對照組(40只)、治療組(40只)。對照組和治療組通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備心肌梗死模型，假手術(shù)組同部位穿線但不結(jié)扎。

1.3心肌梗死模型制作方法對SD大鼠進(jìn)行稱重，水合氯醛腹腔注射麻醉，剔除頸部和左胸的毛發(fā)，切開頸部皮膚，分離皮下組織，行氣管切開呼吸機(jī)輔助呼吸，在胸骨左緣心尖搏動最強(qiáng)處切開皮膚，鈍性逐層分離肌組織，使用眼科剪小心剪開第3～4肋間，開瞼器撐開肋間，充分暴露左心耳及周圍區(qū)域，用紗布壓墊肺臟，在心臟表面噴灑0.05 mL體積分?jǐn)?shù)2%利多卡因注射液預(yù)防心律失常，使用5-0無損傷縫合線從左心耳下1～2 mm進(jìn)針，肺動脈圓錐旁出針，結(jié)扎后觀察左室壁運(yùn)動減弱、顏色變?yōu)榘咨⑿碾妶DST段抬高才能確定心肌梗死模型制備成功。待心電穩(wěn)定之后抽出胸腔內(nèi)氣體，逐層關(guān)胸，防止漏氣，拔出氣管插管，擠壓大鼠胸部，待呼吸正常后縫合氣管及頸部皮膚。注意術(shù)后保溫，直至大鼠蘇醒，抗生素肌內(nèi)注射3 d，并保證充足的飲食供應(yīng)[3]。

1.4心肌梗死模型的篩選模型制備3周后，超聲心動圖檢查大鼠心臟，心肌梗死模型的入選標(biāo)準(zhǔn)[4]：①左室射血分?jǐn)?shù)<60%；②左室短軸縮短率<30%；③超聲科醫(yī)生判斷有1個或者多個層面出現(xiàn)前壁室壁收縮異常的表現(xiàn)。至少符合上述2項(xiàng)方可入選。

1.5LLLI處理心肌梗死模型建立后3周，對梗死模型進(jìn)行LLLI處理。開胸方法同上，但此次剪開第5肋間隙，開瞼器固定，暴露心臟，在距梗死區(qū)心肌表面15 mm處使用二極管激光治療儀(功率6 mW，波長635 nm)照射，持續(xù)時間為125 s，此時心肌所接受的激光能量密度為0.96 J/cm2，3組均進(jìn)行照射，但假手術(shù)組、對照組照射時不接通電源。

1.6心肌梗死區(qū)及邊緣區(qū)miR-21表達(dá)的檢測各組均在低能激光處理后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d腹腔注射麻醉，氣管插管，迅速開胸獲取心臟，置入4 ℃生理鹽水中隨心搏排空腔內(nèi)血液，采集梗死及邊緣區(qū)域組織，放入-80 ℃冰箱保存。總RNA提取參照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行操作。每一個樣本提取1 μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。miR-21引物序列：上游5’-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’，下游5’-GACTGTGACGACTACCCCAA-3’，擴(kuò)增片段大小75 bp；內(nèi)參U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCG GCAGCACA-3’,下游5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’，擴(kuò)增片段大小109 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40個循環(huán)，再從60 ℃加熱至95 ℃獲得相應(yīng)的融解曲線。反應(yīng)過程中未加入逆轉(zhuǎn)錄酶或cDNA模板者作為陰性對照，每個反應(yīng)體系設(shè)3個復(fù)孔。采用2-ΔΔCT法分析miR-21的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同組間miR-21相對表達(dá)量的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1心肌梗死模型制作成功率制備模型后3周，對照組和治療組共剩69只(86.3%)大鼠，死亡原因有不可恢復(fù)的心律失常、術(shù)中嚴(yán)重肺臟損傷、心臟破裂、氣管分泌物過多、術(shù)后心力衰竭等。經(jīng)過超聲篩選，共有53只(66.3%，對照組26只、治療組27只)符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2梗死區(qū)miR-21的表達(dá)結(jié)果見表1。

表1　處理后不同時間各組大鼠梗死區(qū)miR-21相對表達(dá)量的比較

F組間=773.200，F(xiàn)時間=160.300，F(xiàn)交互=79.700，P均<0.001；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；△：與對照組比較，P<0.05。

2.3梗死邊緣區(qū)miR-21的表達(dá)結(jié)果見表2。

表2　處理后不同時間各組大鼠梗死邊緣區(qū)miR-21相對表達(dá)量的比較

F組間=156.600，F(xiàn)時間=16.700，F(xiàn)交互=7.200，P均<0.001；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；△：與對照組比較，P<0.05。

3討論

LLLI主要通過“光生物刺激”對靶組織進(jìn)行治療，對靶組織照射并不會產(chǎn)生顯著的“熱效應(yīng)”，此療法安全性高，操作簡便，成本低廉，已被臨床廣泛接受。Yang等[5]發(fā)現(xiàn)，低能激光的密度為0.96 J/cm2時能夠有效發(fā)揮心肌保護(hù)作用，減少心肌梗死的面積。該實(shí)驗(yàn)中選擇距離心臟表面15 mm進(jìn)行照射，波長635 nm，功率6 mW，持續(xù)時間125 s，此時的能量密度為0.96 J/cm2。

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)[6]證實(shí)miR參與了心肌梗死后的心臟重塑過程，并且miR的表達(dá)與非缺血性心肌病、心律失常、動脈粥樣硬化、心肌再生都有密切關(guān)系，miR很可能被當(dāng)作新型的生物治療劑。miR-21是由單個基因編碼，位于染色體17q23.2，高度保守[7-8]。起初由于miR-21在多種癌組織中過表達(dá)[9]，而被形容為致癌miR。隨著研究的深入，miR-21參與心臟結(jié)構(gòu)重塑已引起廣泛關(guān)注。Kumarswamy等[10]發(fā)現(xiàn)在小鼠壓力負(fù)荷心臟纖維化模型中，miR-21表達(dá)的上調(diào)可減緩內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而部分阻斷纖維化的進(jìn)程。Tu等[11]研究證實(shí)，上調(diào)miR-21通過PTEN/Akt信號通路抑制細(xì)胞凋亡，可以起到心肌保護(hù)作用。Liang等[12]揭示了miR-21和TGFβRⅢ在心肌纖維化過程中存在相互抑制關(guān)系，而TGFβRⅢ是miR-21特異性靶點(diǎn)。

關(guān)于LLLI治療心肌梗死已經(jīng)有很多學(xué)術(shù)成果。如楊繼濤等[13]發(fā)現(xiàn)LLLI處理梗死的心肌能夠顯著降低組織中丙二醛的表達(dá)量，提高超氧化物歧化酶的活性，有效改善心室重塑過程。Tuby等[14]揭示了LLLI能夠提高血管內(nèi)皮生長因子和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，促進(jìn)血管再生，改善梗死區(qū)微循環(huán)，有較好的心肌保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組在LLLI處理后不同時間，梗死區(qū)miR-21表達(dá)低于假手術(shù)組，邊緣區(qū)miR-21表達(dá)高于假手術(shù)組，與Gu等[15]報(bào)道相符。治療組梗死區(qū)及邊緣區(qū)不同時間miR-21的表達(dá)均高于對照組，說明LLLI處理梗死及周邊區(qū)能夠上調(diào)照射區(qū)域內(nèi)心肌細(xì)胞miR-21的表達(dá)。

心臟結(jié)構(gòu)重塑是心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵過程，可伴隨心房顫動、心力衰竭、心肌梗死等疾病[16-18]，miR-21可延緩心肌纖維化，抑制細(xì)胞凋亡。LLLI處理梗死區(qū)及周邊心肌可以安全、高效、特異地上調(diào)miR-21的表達(dá)，起到心肌保護(hù)作用，但調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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Effects of low-level laser irradiation on miRNA-21 expression in rats with myocardial infarction

MAChao,FAXian′en,LIUBing,ZHOUYuyang,HUANGZhenfeng,YUHaibin

DepartmentofCardiovascularSurgery,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordslow-level laser irradiation;rat;myocardial infarction;miRNA-21;cardioprotection

AbstractAim: To observe the effects of low-level laser irradiation(LLLI) on miRNA(miR)-21 expression in myocardial infarct area and the edge tissue.Methods: A total of 110 SD rats were randomly allocated into sham operation group(30 rats), control group(40 rats), and the treatment group(40 rats).Myocardial infarction model in control and treatment groups was made by ligation of the left anterior descending coronary artery.After three weeks the treatment group was given LLLI, the control group and the sham operation group was irradiated at the same site but the device did not power on.At 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 d after irradiation, miR-21 expression was detected using RT-PCR.Results: miR-21 expression was significantly different between different groups and between the center and edge of the infarct area(P<0.001), miR-21 expression at different time points after treatment also had significant difference(P<0.001). The expression of miR-21 in the treatment group was higher than that in the control group at each time point after LLLI treatment(P<0.05), miR-21 expression level peaked at 48 h at the edge of the infarct area in treatment group,and the expression level at different time points was higher than control group and the sham operation group(P<0.05).Conclusion: LLLI treatment could increase the miR-21 expression in core and edge of infarct area, and has better myocardial protection function.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.012

#通信作者，男，1962年8月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：mcatsqsdfive@163.com

中圖分類號R654.2

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81241003；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程衛(wèi)生科技領(lǐng)軍人才資助項(xiàng)目；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)

目資助計(jì)劃資助項(xiàng)目12A320026；河南省科技創(chuàng)新杰出人才計(jì)劃資助項(xiàng)目104200510007；鄭州市科技創(chuàng)新人才培育計(jì)劃領(lǐng)軍人才資助項(xiàng)目

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