穩定感染HPV-16 E6-E7的人喉咽鱗癌FaDu細胞生物學特性觀察>*

路武豪，郭文濤，馮　龍，婁衛華#

1)鄭州大學第一附屬醫院咽喉頭頸外科 鄭州 450052　2)漯河醫學高等專科學校病原生物學與免疫學教研室 漯河 462002　3)河南中醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學科 鄭州450008

穩定感染HPV-16 E6-E7的人喉咽鱗癌FaDu細胞生物學特性觀察>*

路武豪1)，郭文濤2)，馮龍3)，婁衛華1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院咽喉頭頸外科 鄭州 4500522)漯河醫學高等專科學校病原生物學與免疫學教研室 漯河 4620023)河南中醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學科 鄭州450008

關鍵詞感染；HPV-16；人喉咽鱗癌；FaDu細胞

摘要目的：觀察穩定感染HPV-16 E6-E7對FaDu細胞生物學行為的影響和調控。方法：全基因合成HPV-16 E6-E7基因，將其與慢病毒載體pLV-EGFP-C在T4連接酶作用下連接。制備重組HPV-16 E6-E7慢病毒并感染FaDu細胞。將細胞分3組：實驗組(重組HPV-16 E6-E7慢病毒穩定感染的FaDu細胞)、載體對照組(慢病毒空載體穩定感染的FaDu細胞)和空白對照組(未感染慢病毒的FaDu細胞)。分別用CCK-8試劑盒檢測各組細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡情況，Transwell侵襲實驗檢測細胞的體外侵襲能力。結果：獲得穩定感染重組HPV-16 E6-E7慢病毒的FaDu細胞，熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP表達。整合HPV-16 E6-E7基因的FaDu細胞增殖能力和侵襲力均增強，細胞凋亡率降低，S期和G2/M期細胞增加，G0/G1期細胞減少(P<0.05)。結論：成功建立了HPV-16 E6-E7基因整合的FaDu細胞。

喉咽鱗癌是頭頸部鱗癌中常見的惡性腫瘤之一，某些高危型人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)被認為與鱗癌的發生密切相關[1]。研究[2-3]報道稱在HPV感染相關的頭頸部鱗癌中，關聯性最強的型別為高危型HPV-16。尤其是HPV基因組早期區基因E6和E7編碼產物即E6、E7蛋白，是導致其致癌的主要癌蛋白[4]。慢病毒載體是將基因整合入細胞的良好運載工具，操作簡便，并且感染效率高、穩定、安全[5]。該研究通過重組HPV-16 E6-E7基因的慢病毒來感染人喉咽鱗癌FaDu細胞，觀察穩定感染HPV-16 E6-E7對FaDu細胞生物學行為的影響和調控。

1材料與方法

1.1細胞人喉咽鱗癌FaDu細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2重組HPV-16 E6-E7慢病毒的制備和包裝合成HPV-16 E6-E7基因，在T4連接酶的作用下與慢病毒載體pLV-EGFP-C進行連接，并轉化入大腸桿菌DH5α，即獲得重組HPV-16 E6-E7的慢病毒。提取HPV-16 E6-E7慢病毒質粒。參照包裝說明將重組HPV-16 E6-E7慢病毒與輔助載體pH1、pH2按照一定比例混合，用無血清DMEM細胞培養基補足500 μL。充分混勻，室溫靜置15 min。

1.3細胞分組將細胞分為3組：實驗組(重組HPV-16 E6-E7慢病毒穩定感染的FaDu細胞)、載體對照組(慢病毒空載體穩定感染的FaDu細胞)和空白對照組(未感染慢病毒的FaDu細胞)。

1.4E6、E7 DNA的PCR檢測參照Qiagen公司基因組提取試劑盒提取HPV感染FaDu細胞的基因組DNA。PCR擴增鑒定E6、E7 DNA存在情況。E6上游引物5’-GGGATTTATGCATAGTATATAGA-3’，下游引物5’-CTTTTGACAGTTAATACACCT-3’，擴增片段長度為474 bp；E7上游引物5’-AACCGGACA GAGCCCATTAC-3’，下游引物5’-AATTCCTAGTGT GCCCATTAACA-3’， 擴增片段長度為297 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，34個循環；72 ℃末延伸1 min。PCR產物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠分析系統照相。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖情況收集各組細胞并進行細胞計數，將各組細胞密度調整至1×105mL-1，按每孔1×104個細胞接種于96孔板內，各組均設置5個平行孔。在接種后的第1～5天，用CCK-8試劑盒檢測各組細胞吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.7流式細胞術檢測細胞周期用血清饑餓法對細胞進行同步化處理，使各組細胞周期停滯于G0期。每組收集1×106個細胞，加入預冷體積分數70%乙醇，-20 ℃固定30 min，離心去除乙醇，再用PBS洗滌2遍，加入含有10 mg/L的PI和質量分數為0.1%RNA酶的PBS，混勻，室溫避光放置20 min，上流式細胞儀在488 nm波長處檢測。實驗重復5次。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡情況收集各組細胞，調整細胞密度為5×106mL-1，取1 mL細胞懸液，PBS洗滌2次。用100 μL冰預冷的緩沖液重懸細胞，并向細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和2.5 μL PI染液，輕輕混勻，置于冰上，流式細胞儀檢測。實驗重復5次。

1.9Transwell法檢測各組細胞體外侵襲能力將Transwell 小室置于24 孔板中。收集轉染6 h 的各組細胞，用含牛血清白蛋白的DMEM培養基重懸細胞。將Matrigel膠均勻鋪于聚碳酸酯膜內面，在上室中分別加入100 μL各組細胞懸液，下室中加入500 μL含趨化因子的細胞培養基，37 ℃培養箱孵育48 h。顯微鏡下觀察遷徙至膜上的細胞，每組設5個復孔，共重復5次，計數5個高倍視野中的細胞總數，即穿膜細胞數。

1.10統計學處理采用SPSS 17.0對實驗結果進行統計學處理。不同組間細胞增殖能力、周期分布、侵襲能力的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1重組HPV-16 E6-E7慢病毒的制備與設計序列進行同源性比較，重組HPV-16 E6-E7慢病毒在靠近750 bp處有明亮條帶，與目的基因完全一致，見圖1。

M:DNA Marker；1：HPV-16 E6-E7。圖1　重組HPV-16 E6-E7慢病毒電泳結果

2.2E6、E7 DNA的PCR檢測在474 bp可見目的基因E6的條帶，在297 bp處可見目的基因E7的條帶，見圖2。

1：E6；2：E7；M：DNA Marker。圖2　E6、E7 DNA的PCR檢測結果

2.3慢病毒穩定感染FaDu細胞后E6、E7 mRNA和蛋白的表達情況重組HPV-16 E6-E7慢病毒感染的FaDu細胞中可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP的表達，見圖3。穩定感染慢病毒的FaDu細胞E6和E7在mRNA和蛋白水平均呈高表達，見圖4、表1。

2.4CCK-8法檢測細胞增殖情況結果見圖5、表2。

A:實驗組；B:載體對照組；C:空白對照組。圖3　各組細胞熒光顯微鏡觀察結果(×40)

1：實驗組；2：載體對照組；3：空白對照組；4：Hep-2細胞組。圖4　各組細胞E6、E7蛋白的Western blot檢測結果

組別nE6mRNAE7mRNA實驗組52.600±0.220*1.800±0.120*載體對照組50.003±0.0010.003±0.001空白對照組50.002±0.0010.005±0.001Hep-2細胞組52.300±0.2101.700±0.110F255.400460.910P<0.001<0.001

*：與載體對照組和空白對照組相比，P<0.05。

A:空白對照組；B:載體對照組；C:實驗組。圖5　各組細胞培養第2天生長情況的比較(×40)

表2　各組細胞不同培養時間吸光度值的比較

*：與載體對照組和空白對照組相比，P<0.05。

2.5流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡率結果見表3。

表3　各組細胞周期分布和細胞凋亡率比較　%

*：與載體對照組和空白對照組相比，P<0.05。

2.6Transwell實驗結果見圖6、表4。

A: 空白對照組；B: 載體對照組；C: 實驗組。圖6　各組細胞體外侵襲實驗結果(×40)

組別n穿膜細胞數實驗組5117.4±14.8*載體對照組568.4±8.2空白對照組572.0±8.1

F=19.950，P<0.001；*：與載體對照組和空白對照組相比，P<0.05。

3討論

喉咽鱗癌是頭頸部腫瘤中常見的惡性腫瘤，患者以中老年男性為主。大量抽煙和(或)飲酒是主要致癌因素，然而有一部分患者并無大量抽煙和飲酒史，這部分患者可能與HPV感染有關。HPV是一類裸露閉合雙鏈環狀小DNA病毒，基因組全長約8 000 bp。HPV編碼基因分為早期區基因、晚期區基因以及長控制區基因[6]。早期區E6、E7基因編碼產物為E6、E7蛋白，能協同作用于細胞周期調節因子，使細胞停滯在S期，導致細胞基因突變的不斷積累[7]。并且高危型HPV E6蛋白還能激活細胞端粒酶逆轉錄酶轉錄，協同E7蛋白滅活pRb，促進細胞永生化[8-9]。E6、E7被認為是HPV發揮致癌作用的主要癌蛋白。

為此，作者全基因合成了HPV-16 E6、E7基因，將其與慢病毒載體進行重組，感染FaDu細胞，獲得了穩定表達HPV-16 E6-E7的FaDu細胞。分別觀察感染HPV后細胞生物學行為的改變，結果發現實驗組細胞第2、5天的吸光度值與載體對照組和空白對照組比較，均明顯升高，說明感染HPV后細胞增殖能力明顯增強。并且，細胞周期檢測結果也顯示：與空白對照組和載體對照組比較，實驗組S期和G2/M期細胞增加，G0/G1期細胞減少，說明FaDu細胞基因組整合HPV-16 E6-E7可促進細胞分裂增殖。細胞凋亡檢測結果顯示：實驗組與載體對照組和空白對照組比較，細胞凋亡率降低，說明HPV-16 E6-E7整合可抑制FaDu細胞的凋亡。Transwell實驗結果顯示：與載體對照組和空白對照組比較，實驗組穿膜細胞數顯著增加，說明整合HPV-16 E6-E7后細胞侵襲轉移能力增強。

綜上所述，該研究通過觀察穩定感染HPV-16 E6-E7基因的人喉咽鱗癌FaDu細胞生物學行為的改變，推測E6、E7蛋白致腫瘤的作用機制，為進一步探討HPV和人喉咽鱗癌的關系打下基礎。

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Biology characteristic observation of human laryngopharyngeal squamous cell carcinoma FaDu cells stably infected with HPV-16 E6-E7

LUWuhao1),GUOWentao2),FENGLong3),LOUWeihua1)

1)DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofPathogenBiologyandImmunology，LuoheMedicalCollege，Luohe4620023)DepartmentofPathogenBiologyandImmunology，CollegeofBasicMedicalSciences，HenanUniversityofTCM，Zhengzhou450008

Key wordsinfection;HPV-16;human hypopharyngeal squamous cell carcinoma;FaDu cell

AbstractAim: To observe the effect of HPV-16 E6-E7 gene integration on biological behavior of FaDu cells.Methods: Recombinant HPV-16 E6-E7 lentivirus was used to infect FaDu cells. CCK-8 was used to detect the cell proliferation. Flow cytometry was used to detected cell cycle and apoptosis. Transwell invasion assay was used to detected invasive ability. Results: Recombinant FaDu cells with infection by HPV-16 E6-E7 lentivirus expressed green fluorescent protein. The proliferation and invasiveness of FaDu cells with integration of HPV-16 E6-E7 enhanced, apoptosis was inhibited,S phase and G2/M phase cells increased, G0/G1 phase cells reduced(P<0.05).Conclusion: HPV-16 E6-E7 gene integration FaDu cell lines with integration of HPV-16 E6-E7 has been successfully established.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.009

#通信作者，男，1959年9月生，博士，教授，研究方向：咽喉頭頸腫瘤學，E-mail:louweihuazzu@163.com

中圖分類號R739.65

*河南省科技攻關計劃項目112102310679