靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定>*

何玉婷，李　娟，孫冉冉，陳曉龍，申　珅，闞全程，余祖江#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定>*

何玉婷1)，李娟1)，孫冉冉1)，陳曉龍1)，申珅1)，闞全程2)，余祖江1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 4500522)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

關(guān)鍵詞HIF-1α；CRISPR/Cas9；肝細(xì)胞癌；載體構(gòu)建；基因敲除

摘要目的：構(gòu)建靶向低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒，并體外鑒定其敲除效果。方法：設(shè)計(jì)靶向HIF-1α基因的gRNA序列，將其插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒骨架載體pCAG-T7中，轉(zhuǎn)化后挑取克隆，進(jìn)行測序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2和SK-Hep-1，利用嘌呤霉素進(jìn)行篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)獲得HIF-1α基因敲除混合克隆細(xì)胞，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和混合克隆細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了靶向HIF-1α的重組質(zhì)粒pCAG-T7-HIF-1α-gRNA，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染該重組質(zhì)粒后人肝癌細(xì)胞株HepG2和SK-Hep-1經(jīng)CoCl2誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)明顯減弱。結(jié)論：成功構(gòu)建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒載體。

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是指肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，惡性程度高、進(jìn)展迅速、預(yù)后差，是我國常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年增高趨勢[1]。因此，尋找新型的、有效的輔助治療手段對提高HCC的總體生存率顯得尤為重要[2]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor,HIF)-1在缺氧條件下能激活多種缺氧反應(yīng)性基因的表達(dá), 是目前發(fā)現(xiàn)的惟一在特異性低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子[3]。研究[4-5]表明，在前列腺癌、胰腺癌、腦瘤以及肝癌等多種腫瘤中均存在HIF-1α過表達(dá),而在相應(yīng)正常組織中無表達(dá),提示HIF-1α的表達(dá)與腫瘤明顯相關(guān)，HIF-1α通過調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與并影響腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)行為。相關(guān)研究[6]證實(shí)，HIF-1α表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，所以靶向HIF-1α的基因治療策略可能成為HCC治療的新的手段。

近年來興起的CRISPR/Cas9技術(shù)具有強(qiáng)大的基因改造能力并且操作便捷，能夠在體內(nèi)外實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯，其在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛[7]。因此，作者構(gòu)建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體，并利用其敲除人肝癌細(xì)胞中的HIF-1α基因，為進(jìn)一步探索和證實(shí)HIF-1α與肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，CRISPR/Cas9質(zhì)粒骨架pCAG-T7購自北京唯尚立德公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司，轉(zhuǎn)染試劑Easyfect購自無錫藥科美生物科技有限公司。HIF-1α抗體購自美國Novus公司，氯化鈷及其余化學(xué)試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2靶向HIF-1α基因的gRNA的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，首先應(yīng)用在線工具(http://crispr.mit.edu)設(shè)計(jì)出符合實(shí)驗(yàn)要求的gRNA，對其進(jìn)行篩選及脫靶效應(yīng)評估，挑選出特性強(qiáng)的gRNA。gRNA設(shè)計(jì)的主要原則[8]：3’端要有NGG堿基序列的20個連續(xù)的堿基序列，且不包括PAM序列；必須在外顯子區(qū)域且選擇靠前的外顯子，以提高移碼突變的概率；然后利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行全基因組比對，避免選擇脫靶風(fēng)險大的靶點(diǎn)序列，需考慮到gRNA效率以及染色體和核小體三維結(jié)構(gòu)可能造成的空間位阻效應(yīng)所致的Cas9無法結(jié)合的情況。同時選擇出以下3個序列作為靶點(diǎn)序列(圖1和表1)并進(jìn)行體外篩選，以增加成功率和敲除效率。引物由上海生工生物工程有限公司合成。將3對gRNA引物稀釋待用。

圖1　靶向HIF-1α基因靶點(diǎn)位置示意圖

引物名稱引物序列(5-3)HIF-1α-gRNA-1-FAAACACCGTGCGTGTGAGGAAACTTCHIF-1α-gRNA-1-RCTCTAAAACGAAGTTTCCTCACACGCAHIF-1α-gRNA-2-FAAACACCGAACATAAAGTCTGCAACAHIF-1α-gRNA-2-RCTCTAAAACTGTTGCAGACTTTATGTTHIF-1α-gRNA-3-FAAACACCGTCCTCAGTCGACACAGCCHIF-1α-gRNA-3-RCTCTAAAACGGCTGTGTCGACTGAGGA

1.3pCAG-T7-HIF-1α-gRNA載體的構(gòu)建及鑒定

質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖見圖2。PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L HIF-1α-gRNA-F、gRNA-R各1 μL，solutionⅠ5 μL，用ddH2O 稀釋至10 μL。95 ℃反應(yīng)3 min，95 ℃緩慢自然冷卻至25 ℃，16 ℃反應(yīng)5 min。然后將退火產(chǎn)物連接到載體中：pCAG-T7 1 μL，PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，用ddH2O 稀釋至10 μL，充分混合后，室溫(25 ℃)靜置 5 min。取連接產(chǎn)物5 μL加入到剛解凍的50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30 min后，42 ℃熱激90 s，冰上靜置2 min，直接涂于氨芐抗性的平板。第2天，挑選出生長狀況良好的單菌落于20 mL含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)過夜。取5 mL菌液送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序。

圖2　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA重組載體結(jié)構(gòu)示意圖

1.4pCAG-T7-HIF-1α-gRNA對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

按照試劑盒說明書提取陽性質(zhì)粒，將3個構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用TE buffer稀釋至等濃度后等體積混合，測定濃度后待用。將處于生長狀態(tài)良好的人肝癌細(xì)胞HepG2和SK-Hep-1(購自上海中科院細(xì)胞庫)分別消化后接種至12孔板，融合達(dá)60%～80%時進(jìn)行pCAG-T7-HIF-1α-gRNA轉(zhuǎn)染。3個重組質(zhì)粒各取2 μg，分別在聚苯乙烯管中與100 μL Opti-MEM?培養(yǎng)基混合成預(yù)混液，室溫靜置5 min后在預(yù)混液中加入2 μL Easyfect，輕輕吹打，搖晃混勻，室溫孵育20 min。將配制好的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入12孔板中，來回輕柔搖晃培養(yǎng)板，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP蛋白表達(dá)情況，評估轉(zhuǎn)染效率并拍照。轉(zhuǎn)染36～48 h后加入含嘌呤霉素(HepG2和SK-Hep-1最優(yōu)篩選濃度分別為2.0和1.5 mg/L)的無抗生素培養(yǎng)基,48 h后更換為最優(yōu)篩選濃度一半的嘌呤霉素的新鮮無抗培養(yǎng)基維持10～15 d,篩選出基因敲除的混合克隆細(xì)胞株。

1.5細(xì)胞中HIF-1α蛋白的Western blot法檢測用HIF-1α表達(dá)誘導(dǎo)劑CoCl2(200 μmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的HepG2、SK-Hep-1以及混合克隆細(xì)胞24 h，提取蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)，以相應(yīng)條帶灰度值表示表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1pCAG-T7-HIF-1α-gRNA的鑒定挑取的菌液經(jīng)上海英濰捷基公司測序，所得序列與gRNA序列一致，測序比對結(jié)果見圖3。

2.2pCAG-T7-HIF-1α-gRNA對HepG2、SK-Hep-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果見圖4。

2.3基因敲除效果Western blot結(jié)果見圖5、表1?？梢钥闯?，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)CoCl2處理后可見明顯的HIF-1α表達(dá)，而基因敲除的混合克隆細(xì)胞HIF-1α表達(dá)明顯減弱。

圖3　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA測序結(jié)果

左:HepG2；右:SK-Hep-1。圖4　pCAG-T7-HIF-1α-gRNA轉(zhuǎn)染效果圖

A:HepG2；B:SK-Hep-1;1：未轉(zhuǎn)染未誘導(dǎo)；2：未轉(zhuǎn)染+誘導(dǎo)；3轉(zhuǎn)染+誘導(dǎo)。圖5　Western blot結(jié)果

表1　轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平的比較

*:與HepG2或SK-Hep-1比較，P<0.05；與HepG2+CoCl2或SK-Hep-1+CoCl2比較，P<0.05。

3討論

HIF-1是PAS(PER-ARNT-SIM)家族的成員之一,是一個以折疊-環(huán)-折疊為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族，另外還包括結(jié)構(gòu)相似的HIF-2和HIF-3。HIF-1為異源二聚體結(jié)構(gòu)，由對氧含量敏感的HIF-1α亞基和結(jié)構(gòu)性表達(dá)的HIF-1β亞基組成，通過與DNA結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。HIF-1α亞基為特異性活性調(diào)節(jié)亞基，對氧的依賴性較強(qiáng), 起到主要的缺氧調(diào)節(jié)作用。在常氧條件下，HIF-1α蛋白合成后會很快被降解，不發(fā)揮作用[9]。然而,在缺氧的情況下,HIF-1α的脯氨酰羥化被阻斷,未被降解的HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核, 與HIF-1β形成穩(wěn)定的異質(zhì)二聚體, 活化的HIF-1 在其靶基因的轉(zhuǎn)錄起始部位形成一個轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物, 從而啟動對靶基因的轉(zhuǎn)錄，繼而進(jìn)一步發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的作用[10]。HIF-1α是介導(dǎo)生理性和病理性低氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, 在缺氧環(huán)境中表達(dá)相對顯著,活化的HIF-1作用于人類基因組的1%～2%基因,主要調(diào)節(jié)血管形成、細(xì)胞存活/死亡、代謝、pH、黏附、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、遷徙和轉(zhuǎn)移等基因產(chǎn)物的表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān), 并對腫瘤的治療具有重要意義[11]。目前研究[6]表明, HIF-1在由肝臟炎性疾病向肝臟惡性腫瘤的演進(jìn)過程中發(fā)揮著重要的作用，故推測 HIF-1有可能為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步深入探索和研究HIF-1α在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制，該研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，在體外敲除人肝癌細(xì)胞HepG2和SK-Hep-1中的HIF-1α基因，并體外鑒定敲除效果。

CRISPR系統(tǒng)是由成簇間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)和Cas基因(CRISPR-associated genes)組成的系統(tǒng)[12]。CRISPR系統(tǒng)的原理是基于gRNA 序列能夠靶向識別與其互補(bǔ)的DNA 序列,并介導(dǎo)Cas9蛋白特異性地識別及切割該靶位點(diǎn)。同傳統(tǒng)的siRNA和shRNA基因沉默技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠在基因水平實(shí)現(xiàn)對靶基因的敲除，更加穩(wěn)定和徹底。與現(xiàn)有的其他基因編輯工具如鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)相比較，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體構(gòu)建更為簡單和便捷，只需設(shè)計(jì)并改造載體上的目的基因的sgRNA序列即可，并且具備更強(qiáng)的擴(kuò)展性[13]。

實(shí)驗(yàn)中，作者首先將設(shè)計(jì)好的能夠靶向HIF-1α基因的gRNA序列連入gRNA-Cas9體系載體中，構(gòu)建靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體。該重組質(zhì)粒編碼的Cas9蛋白帶有的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)使其能夠與gRNA片段結(jié)合并組裝成gRNA-Cas9 復(fù)合體，在目標(biāo)基因PAM元件的上游實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的斷裂，隨后細(xì)胞利用自身的易錯傾向的非同源末端連接(non-homologous end joining， NHEJ)修復(fù)，同源修復(fù)的過程中會在斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生插入或缺失，繼而發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致靶基因編碼的蛋白發(fā)生改變，從而達(dá)到基因敲除的效果。將構(gòu)建成功的靶向HIF-1α的CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞HepG2和SK-Hep-1中，利用抗性基因篩選獲得HIF-1α基因敲除的混合克隆細(xì)胞，再進(jìn)一步用Western blot法檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)CoCl2誘導(dǎo)后HIF-1α表達(dá)明顯升高，而混合克隆細(xì)胞HIF-1α未見明顯表達(dá)，提示HIF-1α基因敲除成功。

該研究成功構(gòu)建了靶向HIF-1α的CRISPR/Cas9質(zhì)粒載體，為下一步體內(nèi)外水平敲除HIF-1α基因，進(jìn)一步研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用打下了前期基礎(chǔ)。

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Construction and indentification of CRISPR/Cas9 plasmid targeting HIF-1α gene

HEYuting1)，LIJuan1)，SUNRanran1)，CHENXiaolong1)，SHENShen1)，KANQuancheng2)，YUZujiang1)

1)DepartmentofInfectionDiseases，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 2)DepartmentofPharmacology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsHIF-1α；CRISPR/Cas9；hepatocellular carcinoma；vector construction；gene knock-out

AbstractAim: To construct CRISPR/Cas9 knock-out plasmid targeting HIF-1α gene, and identify its knock-out effect in vitro.Methods: The gRNA sequences targeting HIF-1α gene were designed,then were inserted into CRISPR/Cas9 plasmid skeleton vector pCAG-T7,which was transformed into competent DH5α.The single clone was picked up and validated via sequencing. Then the constructed recombinant vector pCAG-T7-HIF-1α-gRNA was transfected into HepG2 and SK-Hep-1, and the HIF-1α gene knock-out mixed colony cell were selected using puromycin. Subsequently, the expression level of HIF-1α in the HIF-1α gene knock-out mixed colony cell lines was detected by Western blot. Results: Through the sequencing validation, the plasmids targeting HIF-1α gene was successfully constructed. The expression levels of HIF-1α in HepG2 and SK-Hep-1 transfected with the recombinant vector were significantly reduced.Conclusion: CRISPR/Cas9 plasmid targeting HIF-1α gene has been successfully constructed.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.002

#通信作者，男，1971年5月生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：重癥肝炎和肝癌的綜合治療，E-mail:johnyuem@zzu.edu.cn

中圖分類號Q781

*河南省科技廳創(chuàng)新人才基金項(xiàng)目124100510010；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年基金項(xiàng)目(2013年)