抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備及其免疫學特性

閆慧麗，席　俊，高學梅，賀夢雪，陳　哲，陸啟玉

(河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001)

抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備及其免疫學特性

閆慧麗，席俊*，高學梅，賀夢雪，陳哲，陸啟玉

(河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001)

摘要：利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，取小鼠脾臟細胞與雜交瘤細胞融合，篩選出2株能穩定分泌抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的雜交瘤細胞株1E3和2F4。體內誘生腹水法大量制備單克隆抗體，經純化后，得到2株均為IgG1型的單克隆抗體mAb1E3和mAb2F4。間接ELISA方法測得mAb1E3的效價達到1∶4.10×105，對Gly m Bd 28K蛋白的半數抑制率(IC50)為23.99 μg·L-1，與花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反應率均低于0.1%。該單克隆抗體的制備為Gly m Bd 28K致敏蛋白的檢測以及抗原表位的鑒定奠定了基礎。

關鍵詞：Gly m Bd 28K；雜交瘤細胞；單克隆抗體；間接ELISA

大豆是優質植物蛋白的來源，大豆及大豆制品多達30余種，以其豐富的營養深受消費者喜愛。然而，大豆中過敏原的存在限制了一部分人對大豆及其制品的攝取。引起大豆過敏的過敏原主要有Gly m Bd 30K，Gly m Bd 28K，Gly m 60K，此外，還有一些致敏原，如大豆疏水蛋白Gly m 1、大豆外殼蛋白Gly m 2、大豆抑制蛋白Gly m 3等[1]。

Gly m Bd 28K是大豆球蛋白7S組分中的一種，能夠被大約25%的大豆過敏患者血清識別[2-3]。Kumari等[4]在黑豆中也分離、純化出了Gly m Bd 28K，這表明Gly m Bd 28K很可能存在于多種豆科植物中。如果能夠了解28K蛋白的致敏機制，降低28K蛋白的致敏性，將使很多對Gly m Bd 28K蛋白過敏的患者受益。本研究擬采用雜交瘤技術制備抗Gly m Bd 28K單克隆抗體，為Gly m Bd 28K過敏原的快速檢測以及致敏機理的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

Gly m Bd 28K天然蛋白：由本實驗室分離純化，經SDS-PAGE鑒定純度，具體方法參照席俊等[5]的論文；弗氏完全佐劑FCA，弗氏不完全佐劑FIA，聚乙二醇(PEG4000)，基礎培養基RPMI-1640，選擇培養基HAT、HT，均為Gibco產品；羊抗小鼠酶標二抗、TMB單組分顯色液，均為Solarbio產品；胎牛血清，Sigma產品；單克隆抗體同種亞型試劑盒，Pierce產品；其他試劑市售所得，均為AR級。

7周齡SPF級BALB/c雌性小鼠4只，購自鄭州大學醫學院實驗動物中心，在河南工業大學糧油食品學院實驗動物房飼養；實驗所用SP2/0骨髓瘤細胞由河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室提供。

1.2方法

1.2.1動物免疫

小鼠免疫前7 d，耳緣采血，制備陰性血清，于-20 ℃保存備用。7 d后，對小鼠進行背部皮下多點注射抗原，具體參照史巧巧等[6]的方法，首次免疫劑量為40 μg·只-1。4周后加強免疫，免疫劑量為第1次免疫的30%，每間隔3周加強免疫1次，共3次。試驗小鼠10 d后斷尾采血，離心(5 000 r·min-1，8 min)，收集上清置于-20 ℃備用。

1.2.2抗體血清效價的測定

采用間接ELISA方法[6]測抗體血清效價。(1)將Gly m Bd 28K天然蛋白用碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋至1 μg·mL-1后包板，50 μL·孔-1，4 ℃過夜，取出后用PBST充分洗滌，拍干；(2) 將200 μL含5%脫脂乳的封閉液加入酶標板， 37 ℃溫育1 h，充分洗滌，拍干；(3)將1.2.1節中的抗體血清從1∶100倍開始，倍比稀釋，加入到酶標板，50 μL·孔-1，分別以小鼠陰性血清和PBS做陰性和空白對照，37 ℃恒溫箱中孵育15 min，完成后PBST充分洗滌，拍干；(4)取辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠酶標二抗，1∶1 000倍稀釋后加入到酶標板，50 μL·孔-1，37 ℃溫育30 min，充分洗滌，拍干；(5)加入50 μL TMB單組分顯色液，室溫避光條件顯色10～15 min后加入等量終止液；(6)在酶標儀上讀取D450值，當P/N≥2.1時，抗體的效價為其最大稀釋倍數。

1.2.3抗體血清敏感性的測定

抗體血清敏感性測定采用間接ELISA方法，1.2.2節中第(3)步改為：將Gly m Bd 28K蛋白稀釋成不同質量濃度(3.125～800 μg·L-1)作為抑制劑(50 μL·孔-1)，加入1.2.2節中測得的D450值在1.0附近的相應稀釋倍數的抗體(50 μL·孔-1)，其余步驟同效價的測定。參照龔芳等[7]論文中方法繪制敏感性曲線，橫坐標為Gly m Bd 28K濃度的對數值，縱坐標為吸光率(B/B0)(B0是Gly m Bd 28K標準品濃度為0時吸光值，B是Gly m Bd 28K標準品不同濃度條件下的吸光值)。依據曲線推導回歸方程，計算多抗血清對Gly m Bd 28K的IC50。

1.2.4雜交瘤細胞株的建立

取免疫效果較好的1只小鼠加強免疫：將40 μg Gly m Bd 28K天然蛋白溶解在200 μL無菌PBS中，注射到小鼠體內。96 h后，取小鼠脾臟細胞與SP2/0以大約1∶10的比例在PEG的作用下進行細胞融合，加入適量含有HAT的完全培養基，轉移到96孔板上，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。10 d后，HAT培養基半量換液。12 d后，取細胞上清用間接ELISA測效價，以融合小鼠血清作陽性對照，以免疫前小鼠血清作陰性對照，篩選陽性孔。14 d后，改用HT培養基，將篩選出的陽性孔轉移至24孔板擴大培養。待細胞長至1/2孔時，再次取上清測效價，對陽性孔進行3次有限稀釋亞克隆。

1.2.5單克隆抗體的制備

單克隆抗體大量制備采用體內誘生腹水法：提前2周注射0.5 mL液體石蠟于BALB/c小鼠腹腔，然后將約1×106個的雜交瘤細胞注入到小鼠腹腔，待小鼠腹腔鼓起變硬后收集腹水，室溫離心(3 000 r·min-1，5 min)，收集上清。

1.2.6單克隆抗體純度和亞型的鑒定

將1.2.5節中上清液通過Protein G Sepharose親和層析柱純化，并以SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度[8-9]。根據單克隆抗體同種亞型試劑盒說明測定單克隆抗體的亞型。

1.2.7單克隆抗體效價和敏感性的測定

單克隆抗體的效價和敏感性測定參照1.2.2節和1.2.3節。

1.2.8單克隆抗體特異性的測定

選取花生蛋白、核桃蛋白、芝麻蛋白、小麥麥谷蛋白(河南工業大學蛋白質提取與制備實驗室提供)作為競爭物，測定Gly m Bd 28K單克隆抗體對這些蛋白的IC50。交叉反應率(CR，%)=Gly m Bd 28K 單克隆抗體對 Gly m Bd 28K的IC50/各競爭物的IC50×100。

2 結果與分析

2.1抗體血清的效價和敏感性

間接ELISA法測得4只小鼠抗體血清效價(圖1)均達到了1∶3.20×103，適合于細胞融合，其中2號小鼠的抗體血清效價最高，達到1∶6.40×103。由圖2可知：4只小鼠中，2號小鼠抗體血清的敏感性最好(圖中數據為3次實驗結果的平均值)，其IC50為75.86 μg·L-1。因此，選取2號小鼠作為融合小鼠。

圖1　小鼠抗體血清的效價Fig.1　Titer curves of mice antisera

圖2　抗體血清的敏感性曲線Fig.2　Sensitivity curves of antisera

2.2單克隆抗體純度與亞型的鑒定

多次克隆篩選后，得到2株雜交瘤細胞株，分別命名為1E3，2F4，其單克隆抗體分別命名為mAb1E3和mAb2F4。mAb1E3和mAb2F4的電泳圖譜(圖3)表明，純化后的抗體在還原條件下只有兩條蛋白條帶，并無其他雜蛋白。采用亞型試劑盒測定mAb1E3和mAb2F4的亞型，結果表明mAb1E3和mAb2F4都是IgG1型。進一步證明電泳圖譜上的2條蛋白條帶為IgG抗體的重鏈和輕鏈，表明純化后的抗體純度較高。

2.3單克隆抗體的效價

M： 標準蛋白； 1: mAb1E3(未純化)； 2: mAb2F4(未純化)； 3: mAb1E3(純化)； 4: mAb2F4(純化)。圖3　SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度Fig.3　SDS-PAGE analysis of the purity of monoclonal antibodies

間接ELISA測得單克隆抗體細胞株1E3和2F4的細胞上清效價分別為1∶1.28×103和1∶6.40×102，其腹水的效價分別為1∶4.10×105和1∶2.05×105，結果見表1。

表1單克隆抗體效價測定

Table 1The titers of Gly m Bd 28K mAb

單克隆抗體細胞上清腹水mAb1E31∶1.28×1031∶4.10×105mAb2F41∶6.40×1021∶2.05×105

2.4單克隆抗體的敏感性

獲得的2株單克隆抗體中，mAb1E3的敏感性較好，其敏感性曲線如圖4(圖中數據為3次實驗結果的平均值)，線性回 歸方程為y=-0.237x+0.828，由此可以得出mAb1E3對Gly m Bd 28K的IC50為23.99 μg·L-1。

圖4　mAb1E3的敏感性曲線Fig.4　The sensitivity curve of mAb1E3

2.5單克隆抗體的特異性

單克隆抗體mAb1E3特異性測定結果見表2。由表2可知，mAb1E3與花生蛋白的交叉反應率為0.096%，與核桃蛋白、芝麻蛋白、小麥麥谷蛋白的交叉反應率均低于0.03%，具有良好的特異性。

表2mAb1E3與其他蛋白的交叉反應

Table 2The cross-reactivity of mAb1E3 with other proteins

蛋白質IC50/(μg·L-1)CR/%GlymBd28K蛋白23.99100.0花生蛋白2.5×1049.6×10-2芝麻蛋白>105<0.03核桃蛋白>105<0.03小麥麥谷蛋白>105<0.03

3討論

制備抗體，首先要考慮的問題就是抗原。一個良好的抗原必須具備足夠大的分子量，較強的外源性和特異性。目前的免疫試驗中，常用的抗原有3類：一類來自純化的天然蛋白；一類來自純化的重組蛋白；還有一類是半抗原與載體蛋白的偶聯物。本實驗室之前利用重組Gly m Bd 28K蛋白免疫Balb/C小鼠，成功制備出抗Gly m Bd 28K重組蛋白的單克隆抗體細胞株3F5，其抗體效價為1∶1.64×106，對重組Gly m Bd 28K蛋白的IC50為3.49 μg·L-1。從結果來看，用重組Gly m Bd 28K蛋白制備出的單克隆抗體的效價和敏感性都高于天然Gly m Bd 28K蛋白制備出的單克隆抗體，這說明抗原的制備方法很可能對抗體的免疫學特性有影響。杜智欣等[10]分別利用提純的黃瓜花葉病毒M株系(CMV-M)病毒粒子和體外原核表達的外殼蛋白免疫健康家兔，制備了CMV-M多克隆抗體。檢測結果表明，兩種CMV-M 多克隆抗血清效價是一致的，但在檢測病汁液靈敏度方面，以病毒粒子為抗原的多克隆抗血清明顯優于以原核表達蛋白為抗原的抗血清，并且前者在樣品量倍比稀釋后Western-blot免疫條帶清晰，后者條帶模糊甚至消失。因此，在制備單克隆或多克隆抗體時，也要考慮到抗原的制備方法可能會對抗體產生的影響，選取合適的抗原制備方法。

細胞融合技術是細胞工程的核心技術，廣泛應用于醫藥、食品、農業等領域，為單克隆抗體的制備以及新物種的培育等提供了有力的技術支持。影響細胞融合成敗的因素較多，本實驗室曾因骨髓瘤細胞生長狀態不好而造成細胞融合的失敗。因此，要保證細胞融合成功，就需要選取處于對數生長期的、沒有污染的瘤細胞。除了瘤細胞的生長狀態，促融劑也是影響細胞融合的一個關鍵因素。本試驗中選用的促融劑是PEG 4000，其促融率相對較高，且價格低廉。由于PEG具有毒性，會對細胞產生損傷，因此PEG的作用時間相當重要。本試驗中，將預熱至37 ℃的PEG在1 min內以一定速度輕柔地加至瘤細胞與脾細胞的混合體系，避免了對細胞的過度損傷，最終保證了細胞融合的成功，并且細胞的融合率達到了79%，有利于進一步篩選陽性克隆。

大豆過敏引發的食品安全問題不容忽視，研究大豆過敏原的結構、特性，降低大豆的致敏性是當前的研究熱點。表位是蛋白質抗原性的基礎[11]，要研究大豆致敏機制，就必須全面了解大豆過敏原的抗原表位。目前，已有學者[12]利用單克隆抗體鑒定出了Gly m Bd 30K的部分抗原表位。本試驗成功篩選出了2株抗Gly m Bd 28K天然蛋白的單克隆抗體，其中mAb1E3的效價達到1∶4.10×105，對Gly m Bd 28K天然蛋白的半數抑制率為23.99 μg·L-1，且特異性較好，與花生蛋白、核桃蛋白、芝麻蛋白、小麥麥谷蛋白的交叉反應均低于0.1%。Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備為Gly m Bd 28K建立了一種快速、靈敏的檢測方法，同時也為進一步的抗原表位研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]曾蕊, 宋波, 拓云, 等. 大豆致敏蛋白及其清除方法的研究進展[J]. 大豆科學, 2011, 30(6): 1040-1046.

[2]LIU B, TENG D, YANG Y L, et al. Development of a competitive ELISA for the detection of soybean α subunit of β-conglycinin[J].ProcessBiochemistry, 2012, 47(2): 280-287.

[3]高學梅, 席俊, 陸啟玉. 大豆中主要過敏原的研究現狀和展望[J]. 糧食與油脂, 2014, 27(12): 9-11.

[4]KUMARI D, ARORA N, KASERA R, et al. Isolation and characterization of a 28 kDa major allergen from blackgram (Phaseolusmungo)[J].Immunobiology, 2012, 217(9): 895-904.

[5]席俊, 高學梅, 閆慧麗, 等. 大豆主要過敏原Gly m Bd 28K的分離純化及多抗血清的制備[J].糧食與油脂, 2015, 28(4): 19-21.

[6]史巧巧, 席俊, 陸啟玉. 苯并芘人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制備[J]. 食品科技, 2013, 38(12): 303-307.

[7]龔芳, 職愛民, 李青梅, 等. 分泌抗春雷霉素單克隆雜交瘤細胞株的建立及免疫學特性鑒定[J]. 中國農業科學, 2013, 46(2): 417-423.

[8]胡鯤, 黃宣運, 姜有聲, 等. 環丙沙星單克隆抗體的制備及其免疫學特性分析[J]. 中國免疫學雜志, 2010, 26(6): 538-543.

[9]蔡秋鳳, 曹敏杰, 劉光明, 等. 鰱魚小清蛋白的分離純化及其單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 中國免疫學雜志, 2011, 27(8): 731-734.

[10]杜智欣, 李桂芬, 馬潔, 等. 兩種抗原制備黃瓜花葉病毒多克隆抗體的比較研究[J]. 植物檢疫, 2013, 27(3): 40-44.

[11]趙鑫, 高美須, 牟慧, 等. 模擬胃液對Pen a 1及其抗原表位免疫原性的影響[J]. 中國農業科學, 2015, 48(4): 769-777.

[12]HOSOYAMA H, OBATA A, BANDO N, et al. Epitope analysis of soybean major allergen Gly m Bd 30K recognized by the mouse monoclonal antibody using overlapping peptides[J].Bioscience,BiotechnologyandBiochemistry, 1996, 60(7): 1181-1182.

(責任編輯張韻)

Preparation of monoclonal antibodies against Gly m Bd 28K and identification of their immunological properties

YAN Hui-li， XI Jun*， GAO Xue-mei， HE Meng-xue， CHEN Zhe， LU Qi-yu

(SchoolofFoodScienceandTechnology，HenanUniversityofTechnology，Zhengzhou450001，China)

Abstract:To establish hybridoma cell lines that secreted anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies， Gly m Bd 28K protein was used to immunize BALB/c mouse， whose spleen was removed for cell fusion. Two hybridoma cell lines that stably secreted anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies were screened and then were injected into BALB/c mice to prepare monoclonal antibodies. After purification of monoclonal antibody， two strains of cell lines were identified for IgG1， named as mAb1E3 and mAb2F4. Indirect ELISA was used to detect the immunological properties of mAb1E3. The titer of mAb1E3 was 1∶4.10×105， and the IC50of mAb1E3 to Gly m Bd 28K was 23.99 μg·L-1. The ratios of cross-reactivity of mAb1E3 with peanut protein， sesame protein， walnut protein and wheat glutenin were less than 0.1%. We successfully prepared the anti-Gly m Bd 28K monoclonal antibodies possessed high sensitivity and specificity. This study provided a basis for the detection of Gly m Bd 28K allergen and the identification of epitopes.

Key words:Gly m Bd 28K; hybridoma cell; monoclonal antibody; indirect ELISA

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.06

收稿日期：2015-08-28

基金項目：國家自然科學基金(31301409)；河南工業大學自然科學基礎研究培育計劃(2014JCYJ01)

作者簡介：閆慧麗(1989—)，女，河南鄭州人，碩士研究生，從事食品安全與品質控制研究。E-mail: yanhuili2000@163.com

*通信作者，席俊，E-mail: xijunhnu@163.com

中圖分類號：S565.1

文獻標志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0748-05

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 748-752

http://www.zjnyxb.cn

閆慧麗，席俊，高學梅，等. 抗Gly m Bd 28K單克隆抗體的制備及其免疫學特性 [J].浙江農業學報，2016，28(5)： 748-752.