PAEs類化合物對雄性小鼠的聯合致毒作用

葛　建，胡華軍，林　芳，伍義行，鄧同樂，張永勇

(中國計量大學 生命科學學院， 浙江 杭州 310018)

PAEs類化合物對雄性小鼠的聯合致毒作用

葛建，胡華軍*，林芳，伍義行，鄧同樂，張永勇

(中國計量大學 生命科學學院， 浙江 杭州 310018)

摘要：為了探討鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters， PAEs)類化合物的聯合毒性作用，將6種PAEs類化合物配制成等質量比的混合物，以低、中、高劑量(40，400，4 000 mg·kg-1)對雄性小鼠灌胃染毒，觀察雄性小鼠骨髓微核形成、精子畸形、血清及肝臟、睪丸等指征的變化，并與相同劑量處理的單一鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)組進行比較，以評價混合PAEs組的聯合毒性作用。結果顯示：高劑量處理時，混合PAEs組的雄性小鼠骨髓微核率及精子畸形率顯著高于單一DBP組；中劑量處理時，混合PAEs組染毒雄性小鼠30 d后的肝損傷及睪丸組織損傷程度也較單一DBP組明顯上升，表明混合PAEs組對雄性小鼠的聯合致毒作用較單一DBP組顯著，不同PAEs類化合物間可能存在一定的協同效應。

關鍵詞：PAEs類化合物；雄性小鼠；骨髓微核率；精子畸形率；聯合毒性

鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters，簡稱PAEs，別名酞酸酯)俗稱塑化劑或增塑劑，主要用于塑料增塑劑、農藥、涂料、印染、化妝品、油漆等領域的生產。PAEs以非共價鍵的形式與聚烯烴類塑料分子相結合，彼此保留各自獨立的化學性質，較易緩慢向環境中釋放[1-5]。近年來研究發現，不同PAEs 類化合物對人及動物存在潛在毒性作用。美國國家環保局(EPA)已將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)等6 種PAEs列入重點控制的污染物名單中[6]。我國優先污染物黑名單中也列出了包括DMP 和DBP 在內的3種PAEs類化合物[7]。目前，國內外關于PAEs類化合物毒性的研究，大多集中于單一化合物的毒性[8-12]，環境中往往是多種PAEs類化合物以混合形式存在，而關于混合PAEs類化合物的毒性研究鮮見報道[13]，所以要考慮2種或更多種PAEs類化合物的聯合毒性。為此，特選擇DMP，DEP，DBP，BBP，DEHP及DPP這6種PAEs類化合物的混合物為對象，探討混合PAEs類化合物的聯合毒性作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

雄性小鼠(ICR)購自杭州師范大學實驗動物中心；蘇木素、伊紅購自珠海貝索生物技術有限公司；Giemsa染料購自上海生工生物工程有限公司；量子點QD610線粒體膜透化檢測試劑購自杭州杏之林生物技術有限公司；環磷酰胺(CP)購自上海第二制藥廠；鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)購自上海百靈威科技有限公司。混合PAEs類化合物配制方法即按等質量混合以上6種PAEs類化合物。全波長熒光分光光度計購自Molecular Devices；光學顯微鏡購自Nikon。

1.2雄性小鼠骨髓微核率測定

取體重約20 g的雄性小鼠90只，隨機分成9組，每組10只。包括：混合PAEs低、中、高劑量組(40，400，4 000 mg·kg-1)，單一DBP低、中、高劑量組(40，400，4 000 mg·kg-1)，陽性對照組(CP)，空白組(植物油)和正常組。各劑量混合PAEs組和DBP組每日1次灌胃染毒，連續4 d，CP組于第3，4天每日1次腹腔注射CP(40 mg·kg-1)，空白組灌胃植物油。第5天，將小鼠脫頸處死，取其兩側股骨骨髓，制細胞涂片。經姬姆薩氏染色后，鏡檢。嗜多染紅細胞(PCE) 呈灰藍色，成熟正染紅細胞(NCE)呈紅色。每張玻片需計數1 000個PCE，并計算含微核的PCE數，取其平均值，在一個PCE中出現2個或多個微核，仍按1個微核細胞計算。微核率按下式計算，并以千分率表示，嗜多染紅細胞微核率(‰)=含微核的嗜多染紅細胞數/嗜多染紅細胞總數×1 000。

1.3雄性小鼠精子畸形率測定

另取體質量約20 g的雄性小鼠90只，分組方法同1.2節。各劑量灌胃染毒組每日1次染毒，連續5 d，CP組于第4，5天每日1次腹腔注射CP(40 mg·kg-1)，空白組灌胃植物油。各組染毒后再正常飼養30 d，將小鼠脫頸處死，取出其雙側附睪放入盛有生理鹽水的離心管中，取精子制成涂片，染色后顯微鏡觀察。每只雄性小鼠觀察1 000個精子，按Wyrobeks的分類標準統計畸形率[14]。

1.4雄性小鼠30天染毒試驗

另取體重約20 g的雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只。由于混合PAEs或單一DBP高劑量連續灌胃1周以上有小鼠死亡現象，而低劑量毒性弱，因此，選擇中劑量作為30 d染毒灌胃劑量。分組包括：混合PAEs中劑量組(400 mg·kg-1)，單一DBP中劑量組(400 mg·kg-1)，空白組(植物油)，正常組。每日1次灌胃染毒連續30 d后，眼球取血，分離得到血清，測定其睪酮(T)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)含量。同時取肝臟組織和睪丸組織備用。

1.5肝細胞線粒體膜透化檢測

將1.4節取材的部分肝組織按梯度差速離心法分離肝組織線粒體，按0.5 mg·kg-1重懸于測定緩沖液(含225 mmol·mL-1甘露醇、70 mmol·mL-1蔗糖、5 mmol·mL-1Hepes，pH 7.2)中，在室溫條件下，分別與線粒體膜透化檢測試劑量子點QD610共孵10 min后，選取激發波長350 nm、發射波長610 nm，用熒光分光光度計測定各組線粒體懸液的熒光強度。

1.6肝組織、睪丸組織HE染色

將1.4節取材的肝臟組織和睪丸組織進行固定，然后依次經過體積分數為85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅲ、95%乙醇Ⅳ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ中進行脫水，脫水后進行石蠟包埋、切片，HE染色觀察組織結構。

1.7數據處理與統計分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，結果以平均值±標準差表示，2組之間顯著性分析采用配對t檢驗，P<0.05為顯著差異，P<0.01 為極顯著差異。

2結果與分析

2.1雄性小鼠骨髓PCE細胞微核率

由表1可見，各組PCE與NCE的比值均為0.6～1.2，代表PCE形成未因染毒而抑制，試驗結果可靠[14]。經染毒后小鼠骨髓PCE細胞微核率均提高，混合PAEs高劑量組與空白組比較存在極顯著差異(P<0.01)，且混合PAEs高劑量組微核率也極顯著高于單一DBP高劑量組(P<0.01)，說明高劑量混合PAEs類化合物遺傳毒性高于單一DBP。

2.2雄性小鼠精子畸形率

結果顯示：各劑量染毒組精子畸形率均高于空白組(13.6±2.16)‰，且混合PAEs高劑量組精子畸變率(60.6±6.86)‰與單一DBP高劑量組(42.0±4.20)‰比較，存在極顯著差異(P<0.01)，說明高劑量的混合PAEs類化合物生殖毒性高于單一DBP。

表1小鼠骨髓微核率及PCE與NCE的比值

Table 1Result of mice micronucleus test and PCE/NCE

組別PCE/NCE微核率/‰正常組0.95±0.013.17±0.98E空白組0.94±0.023.67±1.03DE單一DBP低劑量組0.92±0.023.65±0.88DE單一DBP中劑量組0.89±0.014.32±1.06DE單一DBP高劑量組0.83±0.017.17±0.98C混合PAEs低劑量組0.88±0.014.67±1.21DE混合PAEs中劑量組0.79±0.015.33±1.21D混合PAEs高劑量組0.85±0.0112.83±2.14B環磷酰胺毒性對照組0.83±0.0116.50±2.59A

注：同列數值后無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

2.3雄性小鼠肝線粒體的膜透化程度

混合PAEs中劑量組相對熒光強度顯著高于空白組和單一DBP中劑量組(P<0.05)(圖1)。熒光強度越高，顯示線粒體膜透化越嚴重，即反映出肝細胞的損傷程度。由于肝臟是機體的重要解毒器官，且具有較強的自我修復能力，30 d染毒中劑量混合PAEs組和單一DBP組間沒有極顯著差異，但該結果也表明，中劑量混合PAEs類化合物對雄性小鼠肝損傷作用要比相同劑量單一DBP作用強。

無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1　小鼠肝臟線粒體相對熒光強度Fig.1　The relative fluorescence values of mice liver mitochondrial

2.4雄性小鼠血清睪酮及轉氨酶含量的變化

雄性小鼠血清中T,ALT,AST含量均高于空白組，且混合PAEs中劑量組和單一DBP中劑量組比較存在極顯著差異(P<0.01)(表2)。該結果表明，中劑量混合PAEs類化合物染毒對雄性小鼠肝功能和分泌睪酮激素的影響較DBP明顯。

2.5小鼠肝臟、睪丸組織結構特征

如圖2所示，空白組與正常組小鼠肝小葉結構清晰，細胞排列整齊，胞核及胞質未見明顯異常。混合PAEs中劑量組和單一DBP中劑量組肝組織均有不同程度損傷，前者肝小葉結構部分破壞，細胞排列紊亂，部分細胞有空泡，胞質染色變淺，核漿邊緣不清，后者肝小葉結構相對完整，但細胞排列松散。空白組與正常組小鼠生精細胞呈圓形或卵圓形，細胞間排列整齊，大小均等，致密度高，而染毒組中曲細精管結構紊亂，生精細胞、次級精母細胞從生精上皮脫落明顯，其中混合PAEs中劑量組比單一DBP中劑量組睪丸組織損傷嚴重(圖3)。

表2各組血清中的T，ALT，AST含量

Table 2Concentrations of T， ALT， AST in serum

組別T/(nmol·L-1)ALT/(1×16.67nkat·L-1)AST/(1×16.67nkat·L-1)正常組1.07±0.53B19.68±6.29C98.27±15.64C空白組2.86±1.86B21.37±9.31C103.89±28.53C單一DBP中劑量組5.26±3.89B137.21±67.25B257.57±34.95B混合PAEs中劑量組24.36±8.84A274.41±34.91A418.21±106.44A

A： 空白組；B： 正常組；C： DBP中劑量組；D：混合PAEs中劑量組。400×。圖3同。圖2　肝臟組織HE染色Fig.2　HE stain of liver

圖3　睪丸組織HE染色Fig.3　HE stain of testis

3討論

環境激素又稱環境內分泌干擾物，是環境污染物中的一個大類，主要包括人工合成和工業排放的持久性有機污染物，如有機農藥、多氯聯苯以及塑化劑類等。現代動物毒理學研究也發現，溴系阻燃劑(BFRs)由于在土壤、沉積物、大氣以及生物體內的廣泛暴露，對水生動物、鳥類、哺乳類動物均存在不同程度的毒性[15]。目前，毒理學領域關于農藥的研究尚未開展環境內分泌干擾方面的研究，僅對非靶標動物(如魚、蜜蜂、蚯蚓、蛙類等)相關毒性研究進行評估[16]。本研究以自然環境暴露最常見的DMP，DEP，DBP，BBP，DEHP及DPP等6種PAEs化合物等質量比組成的混合物為研究對象，著重開展了其聯合毒性研究。結果顯示，混合PAEs化合物相比單一DBP在4 000 mg·kg-1染毒劑量條件下，小鼠的骨髓微核率和精子畸形率明顯升高。同時也發現，混合PAEs化合物在400 mg·kg-1劑量條件30 d染毒后血清中ALT，AST活性升高，肝線粒體膜透化增加，肝組織結構異常，其對肝所致聯合毒性比相同劑量DBP單一毒性要強。由于試驗中混合PAEs類化合物和單一DBP對雄性小鼠染毒劑量均相同，而混合形式對雄性小鼠的聯合致毒作用較單一作用強。因此，不同PAEs類化合物間可能存在一定的協同效應，至于不同PAEs所致機體聯合毒性的深層次分子機制有待于進一步探索。

課題組前期研究也發現，PAEs類化合物或其代謝產物易于在動物體內蓄積[17-19]。被攝入機體后致肝損傷，使得機體代謝異常，更進一步抑制了肝代謝功能，導致內源性代謝紊亂，以致引起體內類固醇激素代謝紊亂，從而表現出一系列生殖內分泌相關毒性[20]，包括睪酮水平的明顯改變，最后導致生精細胞發育過程阻滯和出現凋亡，這與小鼠睪丸組織的HE染色結果基本一致。有關DBP生殖毒性的研究報道表明，其導致生殖毒性的主要機制為DBP代謝產物對睪丸間質細胞膽固醇轉運蛋白表達有顯著抑制作用[21]。因此，混合PAEs中每種化合物毒性機制以及協同毒性尚需進一步研究。

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(責任編輯盧福莊)

Study on synergistic toxicity of phthalic acid esters chemicals in male mice

GE Jian， HU Hua-jun*， LIN Fang， WU Yi-hang， DENG Tong-le， ZHANG Yong-yong

(CollegeofLifeSciences，ChinaJiliangUniversity，Hangzhou310018，China)

Abstract:In order to explore the synergistic toxicity of phthalate acid esters (PAEs)， the bone marrow micronucleus formation， sperm deformity， liver and testis damage were carefully observed and determined on male mice， which were exposed to mixed PAEs chemicals with different levels of dose (40， 400， 4 000 mg·kg-1) and single dibutyl phthalate (DBP) with the same doses (40， 400， 4 000 mg·kg-1). It was shown that the bone marrow micronucleus formation rate and sperm deformity rate were obviously higher in the mixed group with high-dose (4 000 mg·kg-1) PAEs than those in the single DBP treatment. Besides， the damage of liver and testis was also higher in the mixed group with moderate-dose (400 mg·kg-1) PAEs than that in the single DBP treatment after 30 d. As mentioned above， the mixed PAEs exhibited more severe toxic effects than single DBP treatment， which suggested that there might be certain synergistic effect among PAEs chemicals.

Key words:PAEs chemicals; male mice; bone marrow micronucleus formation rate; sperm deformity rate; synergistic toxicity

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.07

收稿日期：2015-09-26

基金項目：浙江省分析測試科技計劃項目(2013C37056)

作者簡介：葛建(1979—)，男，安徽蚌埠人，博士，副教授，研究方向為藥物毒理學。E-mail: gejian@cjlu.edu.cn

*通信作者，胡華軍，E-mail: hhj@cjlu.edu.cn

中圖分類號：S859.8；X503

文獻標志碼：A

文章編號：1004-1524(2016)05-0753-05

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 753-757

http://www.zjnyxb.cn

葛建，胡華軍，林芳，等. PAEs類化合物對雄性小鼠的聯合致毒作用 [J].浙江農業學報，2016，28(5): 753-757.