肥胖及代謝綜合征幼鼠肝X受體α的表達

李　靜， 劉戈力， 甄雙平， 張宏玉， 高愛梅， 賈云霞

(1山西省人民醫(yī)院兒科，太原　030012； 2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院兒科; *通訊作者,E-mail:liugeli2001@126.com)

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肥胖及代謝綜合征幼鼠肝X受體α的表達

李靜1， 劉戈力2*， 甄雙平1， 張宏玉1， 高愛梅1， 賈云霞1

(1山西省人民醫(yī)院兒科，太原030012；2天津醫(yī)科大學總醫(yī)院兒科;*通訊作者,E-mail:liugeli2001@126.com)

摘要：目的觀察肥胖及代謝綜合征幼鼠肝X受體α(liver X receptor alpha,LXRα)的表達。方法3周SD大鼠隨機分為普通飲食組(ND組)，高脂飲食組(FD組)和高脂高鹽飲食組(FSD組)。測量體質(zhì)量、體長、腹圍、血壓、血脂、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量等，口服葡萄糖耐量試驗及胰島素釋放試驗評價血糖及胰島細胞功能，計算胰島素抵抗指數(shù)。取新鮮肝臟組織，測定LXRα mRNA的含量。結(jié)果FD組肥胖相關指標及胰島素抵抗指數(shù)顯著高于ND組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。FSD組血壓、血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、血脂等代謝綜合征相關指標均顯著高于ND組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。FD組及FSD組LXRα mRNA的表達顯著高于ND組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。FD組及FSD組LXRα mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論肥胖及代謝綜合征幼鼠LXRα mRNA表達增加，提示LXRα參與了胰島素抵抗，糖脂代謝紊亂的病生理過程。LXRα mRNA可以作為肥胖及代謝綜合征的檢測指標。

關鍵詞：肝X受體；代謝綜合征；肥胖；大鼠

兒童肥胖已經(jīng)成為最嚴重的兒童營養(yǎng)問題，其發(fā)生率和嚴重程度在世界范圍中呈逐年上升趨勢。我國0-6歲兒童總的肥胖檢出率高達7.2%，超重檢出率達19.8%，接近歐美發(fā)達國家水平[1]。兒童代謝綜合征指在兒童時期出現(xiàn)的有可能導致動脈粥樣硬化性心臟病和2型糖尿病的多方面綜合危險因素，如肥胖、高血壓和高脂血癥等，已在肥胖兒童中呈流行趨勢。肝X受體(liver X receptor，LXR)是與代謝綜合征相關的核受體之一。LXR通過影響糖脂代謝，調(diào)節(jié)膽固醇平衡，影響動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪肝的形成來影響代謝綜合征[2]。目前對代謝綜合征和LXR的研究主要集中在成年人和成年動物模型。本研究通過模擬人類肥胖和代謝綜合征的演變過程來研究幼鼠肝臟LXRα的表達與肥胖及代謝綜合征的相關性，探討肥胖和代謝綜合征的發(fā)病機制。

1材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑

3周齡SD大鼠40只，清潔普通雜交動物，購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心，雌、雄各半。

本實驗所用的試劑：DEPC水,吸出1 ml放在1 000 ml雙蒸水中配成1‰DEPC水,放在1 000 ml容量瓶中靜置4 h備用；Trizol(美國GIBCO生物技術公司)；氯仿及異丙醇；75%乙醇(無水乙醇和DEPC水1∶3)；BioTeke super RT Kit試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；2*Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技術有限公司)；DNA Marker Ⅰ(北京百泰克生物技術有限公司)；5*TBE電泳緩沖液；6*電泳載樣緩沖液：0.25%溴粉藍40%蔗糖水溶液貯存4 ℃；溴化乙錠(BE)。

1.2肥胖和代謝綜合征模型制作

按體質(zhì)量分層后隨機分成普通飲食組(ND組)12只，給予普通飼料(大麥粉20%，豆粉20%，玉米粉15%，麥麩15%，花生粉10%，魚粉10%，骨粉5%，酵母粉1%，食鹽2%，混合礦物鹽1.5%，復合維生素0.5%)。高脂飲食組(FD組)14只，給予高脂飼料(含普通飼料65.8%，添加豬油10%，蛋黃粉10%，蔗糖8%，酵母粉3%，混合礦物鹽1.5%，膽固醇1%，豬膽鹽0.2%，復合維生素0.5%)。高脂高鹽飲食組(FSD組)14只，給予高脂高鹽飼料(含普通飼料65.8%，豬油10%，蛋黃粉10%，食鹽8%，酵母粉3%，混合礦物鹽1.5%，膽固醇1%，豬膽鹽0.2%，復合維生素0.5%)。連續(xù)喂養(yǎng)4周。最終存活并且符合入組標準的ND組8只，F(xiàn)D組12只，F(xiàn)SD組9只。

1.3測量三組幼鼠的體格指標及代謝相關指標

實驗4周末(生長至7周末)，在動物安靜狀態(tài)下進行尾動脈無創(chuàng)容積血壓測定(使用成都泰盟科技有限公司的BP-6無創(chuàng)容積血壓測試儀)，連續(xù)測定3次，取其平均值作為測定血壓值(mmHg)。禁食12 h后，取內(nèi)眥靜脈血測量空腹血糖(葡萄糖氧化酶法)，取股靜脈血測定空腹胰島素(放射免疫法)、血脂指標。血脂指標包括總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，TC、TG采用酶法，LDL-C、HDL-C采用直接法。其后，口服葡萄糖(濃度0.5 g/L，2 g/kg)后30，120 min采集內(nèi)眥靜脈血測定血糖及胰島素濃度，采用穩(wěn)態(tài)模型計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR =FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。次日禁食12 h，測量體質(zhì)量、腹圍(abdominal circumference，AC)及內(nèi)臟脂肪質(zhì)量。腹圍是麻醉狀態(tài)下繞過腹部肚臍的周長。采取頸椎脫臼法處死大鼠，取肝臟、內(nèi)臟脂肪組織測定肝臟重量及內(nèi)臟脂肪重量，取肝臟測量肝臟重量，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4RT-PCR測定肝組織中LXRα mRNA的表達

LXRα及β-actin引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成部合成。LXRα上游：5′-TCAGCATCTTCTCTGCAGACCGG-3′，下游：5′-TCATTAGCATCCGTGGGAACA-3′，擴增片段長度486 bp。β-actin上游：5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，下游：5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCTTG-3′，擴增片段長度144 bp?？俁NA提取及目的基因片段的擴增：按照美國GIBCO生物技術公司提供的說明書使用Trizol法提取總RNA，cDNA合成采用BioTeke super RT Kit試劑盒，按標準步驟操作，PCR采用白泰克公司的Power Taq PCR MasterMix，按標準步驟操作。PCR擴增：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s(β-actin：62 ℃ 30 s)，72 ℃延伸45 s，進行30個循環(huán)，最后72 ℃再延伸5 min。PCR反應結(jié)束后取5 μl反應產(chǎn)物和5 μl DNA Marker，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并照相。使用計算機激光圖像分析系統(tǒng)測量LXRα mRNA和β-actin的吸光度×條帶面積之比作為LXRα mRNA的相對表達量。

1.5統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1肥胖及代謝綜合征動物模型制作結(jié)果

喂養(yǎng)4周后，F(xiàn)D組幼鼠體質(zhì)量、腹圍、BMI、HOMA-IR、脂肪重量、肝臟重量顯著高于ND組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。FSD組幼鼠體質(zhì)量、腹圍、脂肪重量、收縮壓、舒張壓、血糖、胰島素、HOMA-IR、LDL、TC、TG均顯著高于ND組(P<0.05)，HDL-C水平低于ND組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。說明肥胖及代謝綜合征幼鼠動物模型制作成功。

組別n體質(zhì)量(g)BMI(kg/m2)腹圍(cm)脂肪質(zhì)量(g)肝臟質(zhì)量(g)ND組8162.03±14.574.81±0.3312.38±0.520.93±0.435.21±0.58FD組12195.42±32.82*5.17±0.76*14.00±0.85*2.42±0.98*7.88±1.76*FSD組9223.56±31.33*#6.63±0.63*#14.44±0.53*3.03±0.57*7.97±0.32*

與ND組比較，*P<0.05；與FD組比較，#P<0.05

組別n空腹血糖(mmol/L)30min血糖(mmol/L)120min血糖(mmol/L)空腹胰島素(mU/L)30min胰島素(mU/L)120min胰島素(mU/L)ND組85.21±0.347.65±1.196.50±0.5124.35±6.0524.69±4.8744.69±4.87FD組125.63±0.33*7.92±0.546.89±0.6935.83±7.32*29.17±9.0159.17±9.01*FSD組95.58±0.41*#8.58±0.46*7.57±0.62*#36.06±4.88*30.45±9.14*#59.53±6.68*

組別n收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)HOMA-IRLDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)ND組8105.97±6.6373.26±3.285.65±1.431.33±0.221.19±0.093.58±0.320.75±0.08FD組12118.11±10.5075.47±6.029.00±2.15*2.19±0.741.05±0.09*4.67±0.90*1.10±0.27*FSD組9126.39±11.11*#82.81±5.629.37±1.26*2.99±2.09*0.98±1.00*4.71±1.05*1.29±0.42*

與ND組比較，*P<0.05；與FD組比較，#P<0.05

2.2三組大鼠肝組織LXRα mRNA相對表達的比較

對三組幼鼠肝臟組織LXRα mRNA相對表達量進行統(tǒng)計學分析，三組之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)；FD組和FSD組未成年鼠肝組織LXRα mRNA相對表達量均顯著高于ND組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，F(xiàn)SD組和FD組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3及圖1)。

組別nLXRND組80.62±0.30FD組121.58±0.86*FSD組91.85±0.55*

與ND組比較，*P<0.05

2.3各組LXRα mRNA的相對表達量與肥胖及代謝綜合征指標的相關性分析

LXRα mRNA的相對表達量與體質(zhì)量、腹圍、BMI、肝臟質(zhì)量呈顯著正相關(P<0.05)，與內(nèi)臟脂肪質(zhì)量呈正相關(P<0.1)，LXRα mRNA的相對表達量與空腹血糖呈正相關(P<0.1)，與30 min血糖、120 min血糖、空腹胰島素、30 min胰島素，120 min胰島素無明顯相關性(P>0.1)。LXRα mRNA的相對表達量與LDL-C、TC、TG、HOMA-IR呈正相關(P<0.1)，與HDL-C和血壓無相關性(P>0.1，見表4)。

圖1　PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片F(xiàn)igure 1　Agarose gel electrophoresis of PCR products

3討論

本研究綜合多種糖尿病、肥胖和高血壓動物模型的特點，以符合現(xiàn)代人的飲食結(jié)構(gòu)和飲食習慣即長時間暴露于高脂和高鹽飲食中，同時考慮到兒童肥胖及代謝綜合征多發(fā)病于青春期初始階段，在幼鼠斷乳后立即給予高脂、高脂高鹽飲食4周，建立肥胖和代謝綜合征幼年大鼠模型。結(jié)果表明，建立的肥胖幼鼠模型具有腹型肥胖、高脂肪質(zhì)量、高體質(zhì)量的特點，代謝綜合征幼鼠模型具有腹型肥胖、高血糖、高血壓、高血TC、TG、LDL-C、低血HDL-C等特點，與兒童肥胖及代謝綜合征的臨床特征[3]相同。

表4LXRα mRNA的相對表達量與各指標的相關性分析

Table 4Correlation between the relative expression of LXR alpha mRNA and each index

項目 rPBMI0.6440.000腹圍0.5150.004脂肪質(zhì)量0.3530.061肝臟質(zhì)量0.6430.000空腹血糖0.3480.06430min血糖0.1950.310120min血糖0.2900.128舒張壓0.0670.740收縮壓0.2050.287空腹胰島素0.3200.85030min胰島素0.1790.354120min胰島素0.2760.147HOMA-IR0.3550.059LDL-C0.4770.009HDL-C-0.3810.410TC0.3250.085TG0.3910.036

代謝綜合征是一組以腹型肥胖、糖耐量異常或糖尿病、高血壓、脂代謝異常為主要表現(xiàn)的綜合征。以往研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征在重度肥胖兒童中高達22.1%[4]。肥胖導致代謝綜合征的關鍵是肥胖所致的胰島素抵抗。肥胖者尤其是腹部肥胖者，其肥大的脂肪細胞胞膜胰島素受體密度降低，胰島素與受體的結(jié)合減少，且對胰島素的抗脂解及脂肪合成作用不敏感。肥胖者通過產(chǎn)生和釋放過多的游離脂肪酸和脂肪細胞因子導致胰島素抵抗。糖尿病和胰島素抵抗動物模型研究顯示，LXRs激動劑可以降低血糖，增加胰島素敏感性，LXRs活化可能有助于延緩胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生發(fā)展[5]。胰島素抵抗與巨噬細胞有密切的關系，肥胖者M1和M2型巨噬細胞的比例紊亂。LXRs有重要的抗炎效果，能控制巨噬細胞的活性，進一步提示LXRs與胰島素抵抗有關[6]。最近研究表明，LXRα可通過下調(diào)11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-HSD1)的表達，減少無活性的皮質(zhì)類固醇向有生物活性的皮質(zhì)類固醇轉(zhuǎn)化，從而減輕內(nèi)臟肥胖和胰島素抵抗[7]。本研究中，肥胖及代謝綜合征幼鼠中胰島素抵抗及LXRα mRNA表達均較對照組顯著增高(P<0.01)，LXRα的表達與胰島素抵抗程度成正相關。

胰島素抵抗時高胰島素血癥往往伴隨肝臟甘油三脂和脂肪酸水平升高，LXR通過調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，調(diào)控肝臟和腸道對膽固醇的吸收和排泌來維持膽固醇的平衡[8]。非酒精性脂肪肝病人LXRα的表達水平與脂質(zhì)沉積水平一致[9]。學齡期兒童肥胖可能促使體內(nèi)LXR的表達量上調(diào)，導致肝損傷和血脂紊亂[10]。本研究也提示LXRα mRNA表達與血脂水平呈正相關，LXR可作為觀察肥胖及代謝綜合征兒童血脂紊亂程度的一個重要指標。

本研究結(jié)果顯示，代謝綜合征組大鼠LXRα mRNA表達量高于肥胖組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示幼年時期LXRα與肥胖的相關性高于其他代謝因素。由于本研究動物模型為幼鼠，代謝綜合征的其他因素對LXRα表達的影響不明顯，可能隨著動物的成熟，肥胖和代謝綜合征大鼠LXRα mRNA表達的差異會顯現(xiàn)出來。代謝綜合征的異常多始于兒童時期，兒童期收縮壓、BMI、血糖、甘油三酯增高，有糖尿病家族史，以及血清胰島素水平增高，均為成年后代謝綜合征風險增加的預測因素。因此，控制兒童時期的肥胖能有效地控制代謝綜合征的發(fā)生進而預防和控制成人心血管危險疾病的發(fā)生。

綜上所述，在肥胖及代謝綜合征形成過程中LXRα表達明顯增加，肝臟中LXR的表達改變可能為肥胖及代謝綜合征的一項預測指標，并提示早期改變LXRα的表達或活性可能成為預防或治療代謝綜合征的理想靶點。另外本研究存在一定局限性，本研究是實驗研究且樣本量少，距臨床研究仍存在一定差距，距臨床實際應用可能還有許多工作要做，如LXRα的靈敏度及特異性等等，且干預LXRα的表達后，是否代謝相關指標有改善等尚需進一步證實。

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Expression of liver X receptor in young rats with fat and metabolic syndrome

LI Jing1，LIU Geli2*，ZHEN Shuangping1，ZHANG Hongyu1，GAO Aimei1，JIA Yunxia1

(1DepartmentofPaediatrics,ShanxiProvincialPeople’sHospital，Taiyuan030012,China；2DepartmentofPaediatrics,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital;*Correspondingauthor,E-mail:liugeli2001@126.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of liver X receptor alpha(LXRα) mRNA in young rats with obesity and metabolic syndrome．MethodsThe 3-week-old SD young rats were divided into three groups: routine diet group(normal control group,n=12),high fat diet group(FD group,n=14), and high fat and high salt diet group(FSD group,n=14)．The body weight, length, abdominal circumference, serum lipids and blood pressure, visceral fat weight were measured. Oral glucose tolerance test and insulin release test were performed to evaluate blood glucose and pancreatic beta cell function, and the insulin resistance index was calculated. LXRα mRNA was detected in flesh liver samples．ResultsIn FD group, the obesity-related parameters and the insulin resistance index were significantly higher than that in normal control group(P<0.05).In FSD group, the metabolic syndrome-related parameters were significantly higher than that in normal control group(P<0.05). The LXRα mRNA expression in FD group and FSD group was higher than that in normal control group(P<0.01), but there was no significant difference between FD group and FSD group(P>0.05).ConclusionThe expression of LXRα mRNA in young rats with obesity and metabolic syndrome is increased, suggesting that LXR is involved in the process of insulin resistance and glucose and lipid metabolism disorders. LXRα can be used as an indicator of obesity and metabolic syndrome.

Key words:LXRα;metabolic syndrome;obesity;rats

作者簡介：李靜，女，1986-02生，碩士，住院醫(yī)師，E-mail：lijingng0224.ok@163.com

收稿日期：2016-01-11

中圖分類號：R589

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0419-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.005