水體和動物源性食品中殘留抗生素的新型檢測技術研究進展*

譚　韜，唐　倩 綜述，伍　彬,劉應杰,曾　雪 審校

(重慶醫藥高等專科學校藥物分析教研室　401331)

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水體和動物源性食品中殘留抗生素的新型檢測技術研究進展*

譚韜，唐倩 綜述，伍彬△,劉應杰,曾雪 審校

(重慶醫藥高等專科學校藥物分析教研室401331)

[關鍵詞]殘留抗生素；檢測技術；樣品預處理；聯用技術

由于醫療、個人護理品、養殖等領域幾十年來的抗生素濫用，有的抗生素在土壤中的殘留量已達到了有機農藥污染物的水平[1]，所帶來的一系列問題已引起警覺。據報道，2013年中國抗生素的產量達12.12萬噸，成為世界第一抗生素生產和消費大國。目前常見抗生素檢測方法為微生物檢測法、免疫學分析法、電磁傳感器、現代儀器法等[2-4]。微生物檢測法用于抗生素殘留檢查的初篩，存在耗時、定性差等問題；免疫法的檢測對象較為單一；傳感器雖可快速檢測多種抗生素，但難以確認種類，而現代儀器法能同時對多種殘留抗生素進行準確檢測。本文就國內外對自然水體、蜂蜜、牛奶、水產品、禽肉、蛋等樣品中殘留抗生素的檢測技術、樣品預處理及應用前景進行綜述，其中重點介紹以色譜法為代表的現代儀器檢測技術。

1自然水體

60多種抗生素在我國地表水中被測出，其總體濃度與檢出頻率均高于其他國家。這些抗生素主要來源于制藥廠和醫院廢水的排放、畜牧養殖的廢水及糞便等殘渣、生活污水。

自然水體中抗生素多為ng/L～μg/L級別，因此良好的樣品富集方法、高效的分離手段及高靈敏檢測器就尤為重要。楊常青等[5]采用固相萃取-液相色譜-串聯質譜(SPE-HPLC-MS/MS)法建立了水中磺胺(SAs)、氟喹諾酮(FQs)、四環素(TCs)和氯霉素(CAPs)4類共16種抗生素同時檢測的方法。該研究選擇了HLB作為固相萃取填料，采用兩種溶劑(甲醇及含氨水的甲醇)組合對目標抗生素進行洗脫，在減少洗脫溶劑用量的同時又提高了回收率，獲得了良好的富集效果，還利于下一步的氮吹操作。該方法的回收率為69.5%～122.6%，檢出限達到0.05～0.32 ng/L。

Hu等[6]采用凍干法(FDP)對樣品進行富集，采用LC-MS/MS法共測量了水樣中26種殘留抗生素。這種富集方法操作簡單，可同時對6大類26種抗生素進行富集，能減小目標分析物的損耗，回收率高，優于液液萃取和固相微萃取技術。富集后的樣品，應選用適合ESI-MS系統的溶劑溶解，必要時需進行冷凍離心(4 ℃)及過濾處理。

較于高效液相色譜(HPLC)，超高效液相色譜(UPLC)具有更省時、更靈敏、分離效果更好、抗基質干擾能力更強等特點。Gros等[7]采用SPE-UPLC-MS/MS對醫院、城市廢水及自然水體中的53種殘留抗生素及其代謝產物進行了檢測。Gros在HLB和MCX間也選了凈化富集能力更好的HLB。研究表明富集前加入EDTA-Na2并采用低pH條件(pH=2.5)，可獲得更好的富集效率。該研究用新型Acquity HSS T3色譜柱取代了C18，使用梯度洗脫技術后更能大大改善峰形、提高分離效果；檢出限達到了ng/L級別，回收率為30%～120%。

目前，HLB材料對水體中殘留抗生素具有較高的富集效率而被優先采用，研究也表明C18柱對于自然水體中的喹諾酮類抗生素有較高的富集效率[8]。由于MS/MS靈敏度高，可對紫外吸收較低的抗生素(如氨基糖苷類)進行檢測，因此常與LC聯用。由于MS強大的定性、定量分析能力，甚至可認為LC不過是MS的進樣系統。

2動物組織類食品

在養殖業中作為治病和促生長藥物的抗生素被動物大量攝入；此外，動物還會通過進食(如水、食物、花蜜等[9])攝入環境中殘留的抗生素。其中，90%的抗生素會以原形和活性代謝產物等形式排到自然界中[10]，使水環境出現持續低濃度抗生素污染，不光會對水生生物產生遠期毒性作用，還會使得水環境中微生物群落產生對抗生素的耐藥性；另一部分抗生素將在動物組織內殘留蓄積進入人類食物鏈，導致人類進一步濫用抗生素。由于動物組織樣品較復雜，含有大量的蛋白質和脂類，如不進行合適的樣品預處理(提取、凈化)及富集，會對色譜柱產生不可逆轉的破壞，因此良好的樣品預處理方案將有助于殘留抗生素的準確檢測。

萃取法是最經典的樣品預處理方案，該方法簡單易行，在對動物組織中殘留抗生素的研究中用得較多。Dasenaki等[11]采用UHPLC-ESI-MS/MS對魚、豬、家禽肉中的17種磺胺類抗生素和5種四環素類抗生素進行了分離分析。該研究采用萃取法對均漿后的樣品進行提取凈化，線性范圍為20～150 μg/kg，線性相關系數高于0.98，檢出限為10～20 μg/kg。

Abdallah等[12]采用了優化了的“QuEChERS” 方法(Quick、Easy、Cheap、Rugged、Safe) 對樣品進行了快速樣品前處理，使用HPLC-HRMS對豬、牛、羊、雞的腎、肝、肉中22種磺胺類抗生素及其代謝產物進行了檢測。該研究檢出限為3～26 μg/kg，定量限為1～88 μg/kg，回收率為88%～112%。

SPE法也常用于這個領域中。Jafari等[13]采用C18富集了雞肉中的殘留抗生素，并第一次采用離子淌度譜檢測了禽肉中的3種抗生素。離子淌度譜具有檢出限低、響應快速、便攜性好的特點。該研究采用了連續電暈放電的電離源，獲得了更高數量級的離子流，提高了檢測分辨能力，線性關系可達0.99以上，定量限為12.5～19.7 μg/kg。

湍流色譜法是一種直接在線進樣預處理技術，能使大分子的生物基質成分與小分子抗生素良好分離。Bousova等[14]采用LC-MS/MS對雞肉中36種抗生素進行了分離分析。該方法先用乙腈與2%三氯乙酸(45∶55,v/v)對均漿后的雞肉樣品進行萃取、離心、過濾之后采用湍流色譜法進行富集凈化。結果表明，湍流色譜法的富集效率優于固相萃取技術，該方法對24種抗生素及其代謝產物的檢出限達到了0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，回收率為80%～120%。

目前LC-MS/MS在動物源性食品中殘留抗生素檢測中大量應用，我國也有成熟的檢測標準(如，GB/T 21317-2007，GB/T21320-2007，GB/T 21315-2007，GB/T 21312-2007等)。在與LC聯用后，MS不光可以對目標抗生素進行定性、定量、結構分析，還能對抗生素在動物體內的代謝產物進行定量和結構分析，這大大方便了藥代動力學的研究[15]。

3蜜、乳、蛋等

抗生素也會在動物所產的蜜、乳、蛋中殘留[16]，各國都明確規定了蜜、乳、蛋中抗生素最大允許殘留量。

3.1色譜質譜聯用技術各國基于LC-MS建立起來的蜜、乳、蛋中抗生素檢測方法(如我國，GB/T 22968-2008，GB/T 18932.25-2005，GB/T 23411-2009等)，基本上采用SPE法對樣品進行凈化富集。

Bohm等[17]用HLB材料的SPE法對蜂蜜樣品進行了預處理和富集，然后采用LC-MS/MS對樣品中37種抗生素進行了準確測量，確定限(CCα)達到了7.5～12.9 μg/kg，檢測容量(CCβ) 達到9.4～19.9 μg/kg，回收率為92%～106%。

Jiménez等[18]也采用了LC-MS/MS對蛋進行檢測。不同的是，該研究采用了加壓萃取技術(PLE)對蛋中殘留抗生素進行了凈化和富集。提取物無需再進行其他的凈化處理，用微孔濾膜過濾后即可直接采用UHPLC-MS/MS進行檢測。該方法一共測定了蛋中41種殘留抗生素，CCα可達到0.5～3.0 μg/L，CCβ 達到1.0～3.0 μg/L。但結果表明，該研究對蛋中殘留四環素的定量分析能力略為遜色。為了得到較高的萃取效率，Xu等[19]采用了改良后的中空纖維液相微萃取技術(HF-SEBLLME)。這種技術需要一種含有金屬絲的中空纖維管，內充萃取液，放入樣品溶液中。開啟磁力攪拌器，含金屬絲的中空纖維管會快速轉動，能大大提高萃取效率。提取物經富集后，采用GC進行檢測，線性范圍為0.20～20.00 ng/mL，檢出限為0.02～0.06 ng/mL，定量限為0.07～0.19 ng/mL,回收率為93.6%～104.6%。研究數據表明這種萃取技術擁有更低的檢出限，優勢明顯。

3.2毛細管電泳技術(CE)邵鈺秀等[20]建立了一種采用電堆積方式在線富集的毛細管電泳技術對牛奶、雞蛋和蜂蜜中四環素、土霉素、強力霉素進行了檢測。在正向進樣電壓作用下，pH值為3的樣品溶液中以陽離子形態存在的TC、OTC和DC在高場作用下快速電泳進入毛細管，當其穿越低電導率樣品和高電導率運行緩沖液界面時，由于進入低場區，其運動速度將立即降低，發生分析物離子在樣品與緩沖液界面處的堆積，由此實現了對分析物的在線富集。在優化條件下，四環素、土霉素和強力霉素的富集倍數分別為86、54和54，檢出限為1.7～2.1 μg/kg,1.8～2.2 μg/kg和1.9～2.2 μg/kg，定量限均為20 μg/kg。

分子印跡技術也可以用于樣品的預處理和富集，具有非常高的選擇性，稱為分子印跡固相萃取技術[21](MIPs-SPE)。Moreno-González等[22]就利用了這種技術，采用CE-MS聯用技術對牛奶中8種喹諾酮類抗生素進行了檢測。首先他在毛細管的一端內嵌進自制的分子印跡材料，通過加壓進樣的方式壓入約22 μL樣品溶液，然后壓入甲醇/水/氨水(60/37/3) 溶液(約60 nL)進行分子印跡材料上保留物的洗脫。加電壓前，還需用緩沖液將這段洗脫物從吸附材料上替換下來。該方法的回收率為70.0%～102.3%。該研究認為此富集技術與在線富集技術并不一樣，因此稱為管內嵌入式富集技術(In-line-MISPE)。該研究還對比了不同方法在測量牛奶中喹諾酮類抗生素時的檢出限和定量限，見表1，該研究所提出的方法具有較高的準確性和靈敏度。

4現狀與展望

抗生素殘留帶來的一系列問題已引起了民眾和政府的重視。研究者們依然在孜孜不倦地尋找著富集效率更高的樣品預處理方法，以及分離效率更好、檢測靈敏度更高、可測種類更多的分離檢測手段，見表2。

表1　不同方法在測量牛奶中喹諾酮類藥物時的檢出限和定量限對比

表2　樣品凈化和富集技術及分離和檢測方法的優劣勢比較

續表2　樣品凈化和富集技術及分離和檢測方法的優劣勢比較

對于抗生素殘留的研究將向著兩個方向發展：(1)快速準確檢驗，其研究重點集中在高效快速的檢測手段開發。目前的研究希望整個樣品的分析時間能控制在25 min以內，可無論是SPE等預處理法，還是LC-MS/MS等檢測技術，都存在著耗時、昂貴、對操作者技術要求過高等問題，難以應對當前廣泛的殘留抗生素檢測需求；而一些快速篩查技術，卻又存在著定性弱、準確性較差、檢測種類單一等問題。未來新型檢測手段必將面臨方便、快捷、準確、可同時檢測多種抗生素等要求的考驗。(2)抗生素的生物代謝情況及環境中的分布、轉歸、降解等情況的研究。這類研究將有助于揭開抗生素在生物體內代謝情況和環境降解情況，也能為殘留抗生素的檢測尋找合適的殘留標識物；還能揭示殘留抗生素在環境中的轉歸及分布規律，為殘留抗生素的環境修復工程提供準確有效的數據和技術支持。

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doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.037

* 基金項目：重慶市衛生與計劃生育委員會醫學科研計劃項目(2015MSXMD99)；重慶醫藥高專自科項目(CQZ2013109,YGZ2014106)。

作者簡介：譚韜(1981-)，講師，碩士，主要從事藥物與生物大分子相互作用方向的研究。△通訊作者,E-mail:wubin3412@163.com。

[中圖分類號]X832;S859.84

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1271-04

(收稿日期：2015-07-08修回日期：2015-12-27)