鈦表面羥磷灰石/殼聚糖-轉化生長因子-β1緩釋微球復合涂層的制備及其對成骨細胞黏附與增殖的影響

茍詩然　張帆　李萌婷　黃婷　鄭立舸.瀘州醫學院附屬口腔醫院口腔修復科，瀘州 646000；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 6004

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鈦表面羥磷灰石/殼聚糖-轉化生長因子-β1緩釋微球復合涂層的制備及其對成骨細胞黏附與增殖的影響

茍詩然1,2張帆1李萌婷1黃婷1鄭立舸1,2
1.瀘州醫學院附屬口腔醫院口腔修復科，瀘州 646000；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院（四川大學），成都 610041

[摘要]目的探討在鈦表面制備羥磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）-轉化生長因子-β1（TGF-β1）緩釋微球復合涂層及其對成骨細胞黏附與增殖的影響。方法通過物理-化學-生物改性聯合方式制備HA/CS-TGF-β1 緩釋微球復合涂層。運用掃描電鏡（SEM）、X射線衍射儀（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等分析涂層的形貌和物相；使用CCK-8及免疫熒光檢測其對成骨細胞的細胞毒性及細胞黏附和增殖的影響。結果成功制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層，該涂層制備具有超親水性，體外釋藥穩定且時間長，成骨細胞在此復合涂層的鈦片上生長無抑制，且對細胞的黏附與增殖具有促進作用。結論HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層在體外對于成骨細胞的黏附與早期增殖有明顯的促進作用，具有良好的運用前景。

[關鍵詞]鈦；表面改性；細胞黏附；細胞增殖

Supported by: The Open Project Program of the State Key Laboratory of Oral Diessase (SKLOD2015OF09).Correspondence: Zheng Lige, E-mail: lzyxy-zlg@163.com.

種植體與骨之間形成良好骨整合是植入成功的關鍵，而骨整合取決于材料表面化學特征和形貌。利用表面改性對鈦表面進行處理，以提高種植體骨結合率及成功率是目前的研究熱點之一。羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）是一種具有良好的生物相容性和骨引導作用，能促進早期骨整合的骨仿生材料[1]。殼聚糖（chitosan，CS）為可降解堿性多糖，具有六元環穩定結構，適于制備受力材料，具有良好的生物相容性和骨引導性[2]。轉化生長因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）能促進成骨細胞的增殖，調節骨的成熟、改建，對骨整合的形成有重要的作用[3]。

本實驗通過物理-化學-生物改性聯合的方式，在鈦表面得到HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層，研究該復合涂層對成骨細胞黏附和增殖的影響，為進一步研究其在種植修復中的應用提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1材料和儀器

TA2純鈦鈦片（寶雞英耐特醫用鈦有限公司），1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC]/N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、明膠粉劑、HA、多巴胺（Sigam公司，美國），CS（浙江金殼生物化學有限公司），TGF-β1及酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒（Cloud-clone公司，美國），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物有限公司）。QUANTA 200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（FEI公司，荷蘭），Magna 550型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，FTIR）（Nicolet公司，美國），p-Quant酶標儀（Bio-Tek公司，美國），X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）（Panalytical公司，荷蘭）。

1.2方法

1.2.1鈦片表面處理將10 mm×10 mm×l mm純鈦鈦片經240、400、800、1 000、1 500號砂紙逐級打磨，丙酮、乙醇清洗后，酸洗，去離子水超聲清洗3遍，干燥備用。

1.2.2微弧氧化 使用Microarc-3.0微弧氧化機進行微弧氧化處理：鈦片為陽極，石墨為陰極，電解液為200 mL去離子水與1 mL硫酸配置。經預實驗，確定微弧氧化條件：電壓200 V，電流密度6 mA·cm-2，氧化時間180 s。

1.2.3明膠緩釋微球的制備將1.5 mL司盤80（Span-80）加入70 mL液體石蠟中預熱至60 ℃，快速攪拌下滴入60 ℃的明膠溶液（1 g明膠+10 mL蒸餾水），攪拌30 min，直至溶液變成乳白色，冰浴冷卻；待明膠溶液冷卻至4 ℃加5%戊二醛4 mL，交聯3 h；恢復至室溫，加入30 mL丙酮，去除油相30 min；異丙醇、乙醇洗滌，抽濾，干燥，得淡黃色粉末，備用。

1.2.4HA/CS涂層的制備將經過微弧氧化處理的鈦片放入1 g·L-1的多巴胺溶液浸泡18 h，干燥；將已溶解的HA（0.4 g HA+40 mL MES）緩慢滴入CS凝膠（1 g CS+50 mL H2O），攪拌1 h；在干燥鈦片表面滴加該溶液，負壓處理10 min，干燥24 h。

1.2.5EDC/NHS交聯TGF-β1蛋白 將100片已制備HA/CS涂層的鈦片分成A、B、C、D、E組，每組20片，為實驗組。另備20片只經1.2.1步驟處理的鈦片為對照組（F組）。備5只編號分別為A、B、C、D、E的裝有20 mL 0.1g·mL-1CS凝膠的燒杯，各加入0.4 g明膠微球，攪拌20 min后放入對應的鈦片各20片，冰浴下各加入0.08 g EDC，溶解后加入0.12 g NHS，隨后立刻加TGF-β1蛋白，A、B、C、D、E組加入蛋白濃度分別為15、30、60、75、250 ng·mL-1，交聯反應12 h，干燥。

1.2.6樣品檢測及體外釋藥 以SEM、XRD、FTIR等檢測涂層表面形貌、成分及親水性。從5個實驗組中隨機取鈦片各5個，平鋪于24孔細胞培養板，加入1 mLPBS緩沖液，于37 ℃恒溫搖床上浸泡0.6 h，暫取出試樣，吸取浸出液至EP管中，于-20 ℃的環境中保存，即為前0.6 h釋放的待測浸出液。再將試樣放回，加入PBS液1 mL，以同樣方法取1、3、5、7、9、11、14 d的浸出液并保存。浸出液樣品稀釋為10%，據TGF-β1蛋白ELISA試劑盒操作說明，于波長450 nm時測定標準品及待測樣品的光密度（optical density，OD）值并繪制標準曲線，根據曲線計算材料14 d內的釋藥量。

1.2.7成骨細胞增殖與毒性研究采用CCK-8法，取雙抗滅菌后各組鈦片各5片平鋪于48孔培養板（鈦片與孔直徑相當）。分離大鼠成骨細胞并進行原代和傳代培養，將P2代的細胞懸液按每孔100 μL接種于各組， 37 ℃、5%CO2培養箱中培養；于1、3、7 d分別取出培養板，每孔加CCK-8試劑溶液20 μL，37 ℃下孵育2.5 h后每孔取110 μL液體到96孔板內，酶標儀450 nm測定各孔OD值。

1.2.8成骨細胞的黏附與增殖 將成骨細胞按每孔1×103個細胞密度接種于各組材料表面，每孔100 μL細胞懸液，補足含10%胎牛血清的DMEM培養液，“8”字搖勻后放入37 ℃孵育箱。分別培養6 h及3 d后，吸出培養液，常溫PBS反復沖洗3次，加入200 μL 2.5%的戊二醛4 ℃下固定15 min，吸出戊二醛，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料孵育20 min，PBS沖洗3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3統計學分析

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，定量資料采用描述，統計方法采用單因素方差分析，組間比較采用SNK（Student-Newman-Keuls test）法，檢驗效能α=0.05。

2　結果

2.1處理后鈦片的表面形貌

鈦表面微弧氧化后的SEM圖像見圖1。由圖1可見，鈦表面形成大小和間距基本一致的小微孔，較大微孔孔徑約1 μm，較小微孔孔徑約20 nm，孔洞占有率平均為13.022%。載TGF-β1蛋白的明膠微球表面形貌見圖2。由圖2可見，復合涂層載TGF-β1蛋白的明膠微球表面呈圓球型，粒徑較均勻，未見微孔和裂紋。測得明膠微球粒徑為8～30 μm，占表面的92.323%，平均粒徑為（18.36±3.07） μm。

圖1　微弧氧化后鈦片的表面形貌　SEM　× 10 000Fig 1　Surface morphology of titanium sheet after microarc oxida- tion　SEM　× 10 000

圖2　載TGF-β1蛋白的明膠微球表面形貌　SEM　× 500Fig 2　Surface morphology of gelatin microspheres with TGF-β1　SEM　× 500

2.2XRD、FTIR檢測結果

由XRD圖譜可見，未經處理的鈦片出現明顯的鈦基峰，僅存在很弱的銳鈦礦型二氧化鈦峰；而經微弧氧化后，樣品表面銳鈦礦型和金紅石型的二氧化鈦峰均相當明顯，鈦基峰明顯減弱；當鈦表面制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層后，基體鈦峰幾乎被湮沒，2θ=31.7°出現特征峰，這與HA標準粉末衍射數據譜峰的（211）晶面的特征峰位置吻和，且2θ 在15°～30°范圍內出現CS的特征峰（圖3）。FTIR圖譜可在1 641～1 667 cm-1處對應酰胺基團，證明涂層表面存在大分子多肽。3 593 cm-1處對應非水羥基的振動吸收峰，可證實HA官能團在涂層中存在（圖4）。

圖3　XRD檢測結果Fig 3　Result of XRD

圖4　FTIR檢測結果Fig 4　Result of FTIR

2.3接觸角

未處理的鈦表面接觸角為68.2°±1.5°；經多巴胺和微弧氧化處理后接觸角為26.8°±1.3°.。HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層制備完成后接觸角幾乎為零，即具有超親水性。

2.4體外釋藥

根據標準品TGF-β1蛋白濃度的OD值，得到標準品曲線y=3.885 5x+0.275 2，將樣本OD值代入，可得A、B、C、D、E組平均釋放濃度分別為（0.485± 0.022）、（0.976±0.021）、（1.992±0.023）、（2.493± 0.022）、（8.011±0.019） ng·mL-1。HA/CS-TGF-β1體外釋藥情況見圖5。由圖5可見，6 h、1 d、7 d、14 d時釋放量分別達（25.3±1.8）%、（30.1±1.7）%、（58.4±1.8）%、（80.1±1.9）%。

2.5成骨細胞增殖測定

通過CCK-8檢測大鼠成骨細胞于1、3、7 d后的相對增殖率（圖6）。1 d時各組之間差異不明顯（P>0.05）；3 d時，各組細胞數量均有明顯增長，且實驗組細胞密度大于對照組的細胞密度（P<0.05），B、C組細胞增殖大于其他組；7 d時，實驗組細胞增殖情況明顯優于對照組（P<0.05)， B、C組細胞增殖明顯大于其他組（P<0.05)，E組細胞密度小于其他實驗組（P<0.05)。

圖5　藥物體外累積釋放曲線Fig 5　Drug accumulation release profile in vitro

圖6　成骨細胞增殖情況Fig 6　Osteoblast proliferation

2.6成骨細胞的黏附和增殖

DAPI染色發現：接種6 h時，實驗組與對照組細胞數量無明顯差距；在3 d時，各組均有明顯增殖，B、C組尤其明顯，E組細胞數量少于其他實驗組，但所有的實驗組細胞數量均高于對照組（圖7）。

圖7　各組成骨細胞細胞核不同時期的DAPI染色結果　DAPI　× 100Fig 7　DAPI nuclear stain of different stages of osteoblasts in each group　DAPI　× 100

3　討論

通過表面改性使種植體具有生物功能性，從而縮短種植周期，獲得早期骨整合和更高的結合強度是口腔材料研究的熱點。由于種植適應證的擴大，尤其是運用于全身性疾病如糖尿病、骨質疏松等的患者時，單一的鈦種植體材料表面改性和簡單的制備工藝已不能滿足目前的臨床要求，結合物理、化學、生物化學方法及材料優點的改性技術是今后提高種植體表面活性的必然趨勢[4]。

目前，化學改性如離子噴涂HA涂層已廣泛應用于種植領域，取得了一定的效果[5]，但離子噴涂設備成本高且在骨-涂層-金屬界面存在著涂層不均一、易剝脫等問題[6]。因此本實驗對制備HA層進行了改進：通過微弧氧化在鈦片形成的微孔，引入納米級HA和CS形成膠體液涂在鈦片表面，再通過加熱，形成一層結合牢固的HA薄膜，并使用多巴胺將其緊黏附于鈦片表面，通過負壓處理使HA/CS復合涂層充分滲入鈦內部，從而克服了傳統涂層易于脫落的缺點。同時，Meirelles等[7]研究也證明了鈦種植體表面納米HA涂層的骨接觸率明顯高于普通HA涂層。

本實驗使用明膠微球吸附TGF-β1，形成微球控制釋放系統，又通過EDC/NHS直接交聯TGF-β1蛋白，大幅度提高了載藥量，再通過CS凝膠將整個復合涂層形成整體，將明膠微球包裹于內，形成緩釋系統。涂層的蛋白釋放速率主要取決于蛋白擴散速度和材料降解速度，而明膠微球在pH>7時完全降解約需2個月左右，且大分子肽類物質自微球向外部擴散速度較慢[8]；EDC/NHS交聯后涂層穩定性增強，抵抗酶解的能力顯著增加；凝膠體系的降解速度較慢；這些因素都決定了此復合涂層具有良好的緩釋性能。通過體外釋藥實驗可見，除釋藥初期具有“突釋”效應，以后蛋白釋放逐漸平緩。有研究[9]報道可利用層-層自組裝的方法，通過帶相反電荷的聚電解質在材料表面交替沉積形成聚電解質多層膜來調節多層膜的厚度及多層膜中附載的物質及其釋放速度，因此筆者也考慮在下一步的研究中利用CS和明膠在鈦種植體表面制備聚電解質多層膜，在多層膜中附載蛋白，來解決“突釋”問題。

良好親水性的表面與細胞黏附有密切關系，親水性的樣品表面有利于從所處的周圍環境中吸附蛋白質和具有極性或者離子性的營養物質，進而影響細胞的黏附與增殖和分化。本實驗制備的復合涂層具有超親水性，由細胞的黏附與增殖實驗可以看出該涂層確實有利于細胞的增殖；同時由于鈦片表面存在微孔、HA、明膠微球等，使復合涂層具有粗糙多孔的微觀結構，更利于細胞的早期黏附。

HA/CS-TGF-β1緩釋微球復合涂層能促進成骨細胞增殖生長，且TGF-β1蛋白釋放濃度在一定范圍內時，此作用尤為明顯。證明TGF-β1蛋白釋放濃度在低濃度時促進細胞的增殖，在高于10 ng·mL-1時，將抑制細胞增殖，卻促進細胞的分化[10]。

綜上所述，本實驗對傳統的表面改性進行改進，改性過程中基本未引入可能產生生物學危害的物質且改性后的表面具有多功能性，在體外對于成骨細胞的黏附與早期增殖具有明顯的促進作用。但生物體體內環境復雜，因此復合涂層的體內釋藥及生物功能還需進一步動物實驗驗證。

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（本文編輯杜冰）

Preparation of hydroxyapatite/chitosan-transforming growth factor-β1 composite coatings on titanium surfaces andits effect on the attachment and proliferation of osteoblasts

Gou Shiran1,2, Zhang Fan1, Li Mengting1, Huang Ting1, Zheng Lige1,2.(1.Dept.of Prosthodontics, Hospital of Stomatology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China;2.State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

[Key words]titanium;surface modification;cell adhesion;cell proliferation

[Abstract]Objective This study investigated the effects of hydroxyapatite (HA)/chitosan (CS)-transforming growth factor-β1 （TGF-β1） composite coatings on titanium surfaces， as well as on the attachment and proliferation of osteoblasts.Methods HA/CS-TGF-β1 composite coatings were prepared on titanium surfaces by physical， chemical， and biological modifications.Scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD), Fourier transform-infrared spectroscopy (FTIR), and other methods were employed to analyze the chemical composition and surface topography of the composite coatings.CCK-8 and immunofluorescence assays were used to analyze the effects of the coatings on the attachment and proliferation of osteoblasts.ResultsHA/CS-TGF-β1 composite coatings were successfully prepared.Their contact angle was almost zero.These composite coatings were applied in vitro, with a drug released early and a burst release effect.The growth of osteoblasts was not inhibited on it and it had obvious promoting effect on the adhesion and early proliferation of osteoblasts.ConclusionThe composite coatings significantly promote the adhesion and early proliferation of osteoblasts in vitro.This finding shows that the proposed method demonstrates a good prospective application in surface modification of titanium.

[中圖分類號]R 783.2

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.003

[收稿日期]2015-09-25； [修回日期]2016-03-05

[基金項目]口腔疾病重點實驗室開放課題（SKLOD2015OF09）

[作者簡介]茍詩然，碩士，E-mail：dddddd0904@126.com

[通信作者]鄭立舸，教授，學士，E-mail：lzyxy-zlg@163.com