早期卵清蛋白誘導(dǎo)的兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的建立與評(píng)估①

鄭　擎　陳樹強(qiáng)　繆蔚冰　鄭　玲　陳　靜　陳君敏

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福州350003)

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早期卵清蛋白誘導(dǎo)的兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的建立與評(píng)估①

鄭擎陳樹強(qiáng)繆蔚冰鄭玲陳靜陳君敏

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福州350003)

[摘要]目的：探索雞卵蛋白誘導(dǎo)性兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型在早期關(guān)節(jié)中的應(yīng)用，并評(píng)估超聲引導(dǎo)下AIA模型關(guān)節(jié)腔穿刺活檢，在活體中連續(xù)動(dòng)態(tài)地獲取病理標(biāo)本的可行性、安全性。方法：將25只新西蘭大白兔卵蛋白誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組(AIA組)20只，對(duì)照組5只。在造模后高頻超聲分別觀察超聲影像特點(diǎn)。以ELISA法檢測(cè)VEGF和TNF-α水平。在4、8、12、15周，超聲引導(dǎo)下活檢，獲取滑膜病理，制作病理切片，鏡下觀察病理改變。結(jié)果：(1)模型各時(shí)間觀測(cè)點(diǎn)測(cè)量的AIA組滑膜厚度、VEGF、TNF-α均高于對(duì)照組基線水平，具有顯著性差異(P<0.05)。(2)關(guān)節(jié)炎模型4周至8周期間，以病理學(xué)評(píng)分作為金標(biāo)準(zhǔn)，滑膜厚度、VEGF、TNF-α結(jié)果與病理學(xué)評(píng)分具有相關(guān)性。(3)超聲引導(dǎo)下滑膜活檢成功率為95%，術(shù)后無感染、出血、關(guān)節(jié)骨質(zhì)損傷的情況。結(jié)論：(1)卵清蛋白誘導(dǎo)的兔類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型可作為觀察早期(8周前)關(guān)節(jié)炎病理生理改變的研究模型。(2)超聲引導(dǎo)下的滑膜活檢，可有效安全地獲取病理標(biāo)本。

[關(guān)鍵詞]類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；動(dòng)物模型； 超聲； VEGF；TNF-α

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種中小關(guān)節(jié)炎性損害為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)損害常以近端指間關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)為多見。病情遷延可導(dǎo)致關(guān)節(jié)毀損以及相關(guān)臟器的累及[1]。因此目前臨床上多建議早期診斷與達(dá)標(biāo)治療[2]。RA早期相關(guān)的臨床研究不斷深入，但由于臨床研究的局限性，如RA患者的就診時(shí)間一般在癥狀出現(xiàn)之后、患者血清與影像學(xué)采集的依從性等因素，通常在診療過程中難以觀察到關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的早期情況以及關(guān)節(jié)病變從無到有的過程。故建立可靠的極早期關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型變得較為迫切。之前已有動(dòng)物研究以卵清蛋白誘導(dǎo)并建立的兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型(AIA模型)，但該模型常于建模后8周經(jīng)行相關(guān)數(shù)據(jù)采集，而此時(shí)關(guān)節(jié)病變已相對(duì)晚期。尚未有相關(guān)研究探討該模型關(guān)節(jié)炎的早期情況。故本研究建立兔AIA模型，并以高頻超聲、血清VEGF、TNF-α、病理活檢等手段評(píng)估該模型的早期關(guān)節(jié)炎情況。同時(shí)該研究嘗試以超聲引導(dǎo)下滑膜活檢的方式，連續(xù)的獲取滑膜病理標(biāo)本，并研究該方法對(duì)于動(dòng)物模型的可靠性與安全性。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物及試劑6月齡雄性新西蘭大白兔25只，稱量體重大約在2.5～3.0 kg，常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)按照隨機(jī)對(duì)照表分為模型組(20只)和對(duì)照組(5只)。

試驗(yàn)試劑主要有：雞卵清蛋白(OVA,美國Sigma 公司)，弗氏完全佐劑(美國Sigma 公司)，兔TNF-α和VEGF ELISA試劑盒(USCNLIFE公司)。25%氨基甲酸乙酸、生理鹽水、10%甲醛溶液、石蠟、蘇木素-伊紅染色劑、乙醇溶液、石碳酸二甲苯、二甲苯溶液、鹽酸乙醇、石碳酸二甲苯(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)、戊巴比妥鈉(上海源葉生物科技有限公司)。

1.1.2儀器Philips-iU22彩色多普勒超聲診斷儀、酶標(biāo)儀 (Thermo，MuLTiSKAN MK3)、多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)( 福建省科學(xué)器材公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋 (上海江星儀器有限公司 )、超低溫冰箱 ( 青島海爾特種電器有限公司)、18G活檢針(美國BARD medical公司，規(guī)格18G)光學(xué)顯微鏡(Olympus，CX13)

1.2方法

1.2.1模型制作方法參考Atkinson[3]與Qiu[4]等人所使用的方法AIA建立關(guān)節(jié)炎模型。主要步驟包括：(1)基礎(chǔ)致敏： 20 mg/ml的OVA生理鹽水1 ml，兔肩胛間區(qū)的5個(gè)部位進(jìn)行皮內(nèi)注射，每周 1 次，連續(xù) 3周[5-7]。(2)局部注射：在脛骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)與髕骨下緣連線之中點(diǎn)的髕韌帶兩側(cè)，雙膝各注射 1 ml雞卵清蛋白乳劑(10 mg/ml)。(3)對(duì)照組分別于相應(yīng)部位注射生理鹽水。

1.2.2多普勒超聲檢測(cè)各組分別于在末次膝關(guān)節(jié)注射后的24、72 h以及第1至8周，以Philips-iU22(探頭頻率7～12 MHz)，對(duì)雙側(cè)膝關(guān)節(jié)分別檢查病變情況，每周1次，并觀察如下情況:測(cè)量髕上囊滑膜厚度、關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜彩色血流信號(hào)并分級(jí)[8,9]。

1.2.3TNF-α與VEGF的檢測(cè)各組分別于末次膝關(guān)節(jié)注射后，經(jīng)耳中央動(dòng)脈采血2 ml，采血時(shí)間與超聲檢查時(shí)間同步，采用ELISA測(cè)定VEGF、TNF-α水平，具體操作步驟參照試劑盒說明要求。

1.2.4超聲引導(dǎo)下病理活檢在4、8、12、15周以1%戊巴比妥(6 mg/kg)腹腔麻醉后，固定動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，對(duì)雙膝關(guān)節(jié)處備皮，取30～45屈膝位，常規(guī)消毒，活檢針超聲引導(dǎo)下由臏韌帶附著點(diǎn)處上方約0.5 cm處進(jìn)針；當(dāng)超聲影像提示活檢針進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)病變滑膜處后，迅速采集滑膜病理標(biāo)本，退出活檢針，按壓止血。

1.2.5病理制片與病理分級(jí)用甲醛固定90 min。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、HE染色。根據(jù)Krenn等[10]學(xué)者提出的滑膜病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別評(píng)分?？偡种?～3分為1級(jí)，3～6分為2級(jí)，6～9分為3級(jí)，詳見表1。

2結(jié)果

2.1對(duì)照組與AIA組動(dòng)物模型的一般情況對(duì)照組動(dòng)物生長平穩(wěn)，飲食、飲水、關(guān)節(jié)情況正常。AIA組在末次膝關(guān)節(jié)注射后24 h后，皮膚溫度增加，關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限。

2.2對(duì)照組與AIA組超聲影像學(xué)改變?cè)趯?duì)照組中，超聲提示兔雙膝關(guān)節(jié)面光滑，滑膜無增厚，無明顯血流信號(hào)。在模型組中，超聲可觀察到的滑膜增厚現(xiàn)象，出現(xiàn)在關(guān)節(jié)腔注射后的24 h；多普勒超聲所提示的血流信號(hào)大約出現(xiàn)在模型建造后的第三天；上述滑膜增厚與血流信號(hào)改變所提示的滑膜炎隨時(shí)間推移逐步加重，見圖1～3。AIA組滑膜厚度與對(duì)照組相應(yīng)指標(biāo)相比，具有顯著差異(一般線性模型，Greenhouse-Geisser 0.362,P<0.05)，見圖4、5。

表1滑膜病理評(píng)分

Tab.1Synovial pathology of score

PathologypresentationScoreAHyperplasiaofsynoviallinincelllayerAbsent0Slightenlargemnet(twotothreecelllayers),giantcellsareveryrare1Moderateenlargement(fourtofivecelllayers),somegiantcellsorlymphocytes2Strongenlargement(morethansixcelllayers),giantcellsarefrequent3BInflammatoryinfiltrationAbsent0Slightinflammatoryinfiltration1Moderateinflammatoryinfiltration2Stronginflammatoryinfiltration3CActivationofsynovialstromaAbsent0Slightsynovialstromaactivation1Moderatesynovialstromaactivation2Severesynovialstromaactivation3Totalscore9Totalscore0-3forGrade1,score3-6forGrade2,score6-9forGrade3

2.3模型組與對(duì)照組血清學(xué)改變?cè)趯?duì)照組中，血清VEGF與TNF-α水平在試驗(yàn)全程中與起始基線值相比無明顯差異。在AIA組中動(dòng)物血清中VEGF與TNF-α水平在4周前平緩升高，上升趨勢(shì)在4至8周之間逐步顯著；AIA組與對(duì)照組相比，VEGF與TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖5。

2.4病理學(xué)結(jié)果在進(jìn)行超聲引導(dǎo)下穿刺后，將滑膜病理制片后，鏡下觀察滑膜增生、周圍組織炎性細(xì)胞浸潤等情況[11]，根據(jù)Krenn等[10]學(xué)者提出的滑膜病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別評(píng)分。在4周時(shí)，鏡下以增生腫大的滑膜被覆細(xì)胞為主，以1級(jí)病變居多(圖6)；8周時(shí)，鏡下可見被覆細(xì)胞，伴炎性細(xì)胞輕中度浸潤，以2級(jí)為主；12周至15周的病理分級(jí)均達(dá)3級(jí)滑膜，鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤并伴有血管翳增生(圖7)。結(jié)果詳見表2。

2.5超聲引導(dǎo)下滑膜活檢結(jié)果第4、8、12、15周，對(duì)AIA組20只模型動(dòng)物，分別進(jìn)行了超聲引導(dǎo)下的滑膜活檢，在總共160次的滑膜活檢中，成功率95%(152/160)，失敗原因?yàn)槁樽砩疃炔蛔恪Ｐg(shù)后經(jīng)大體觀察與超聲檢查，無一出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)感染、出血、關(guān)節(jié)骨質(zhì)損傷的情況，詳見表3。

圖1　造模第4周，滑膜增生Fig.1　Week 4, hyperplasia of membranesNote: The grade 2 synovial membrane in Philips-iU22,7-12 Hz liner probe in week 4:synovial membrane covered the top of bone surface,but did not exceed the trunk.

圖2　造模第8周，滑膜增生Fig.2　Week 8, hyperplasia of membranes.Note: The grade 3 synovial membrane in Philips-iU22,7-12 Hz liner probe in week 8:synovial membrane covered the top of bone surface and exceed the trunk.

2.624 h至8周時(shí)，AIA組滑膜厚度與VEGF、TNF-α的相關(guān)性AIA組中，超聲滑膜厚度與VEGF、TNF-α具有顯著相關(guān)性(Pearson檢驗(yàn)，R= 0.869,P<0.05)見圖8、9。

2.7病理與滑膜厚度、血清VEGF、TNF-α的相關(guān)性在關(guān)節(jié)炎模型第4周、第8周，滑膜厚度、血清學(xué)、病理學(xué)檢測(cè)的相關(guān)性檢驗(yàn)提示：血清VEGF與TNF-α水平,滑膜厚度與病理評(píng)分具有相關(guān)性，P<0.05，見表4。

圖3　造模第4周，增生的滑膜內(nèi)見條狀豐富的彩色血流信號(hào)Fig.3　Week 4, hyperplasia of membranes with blood flowNote: The grade 3 blood flow in Philips-iU22, 7-12 Hz liner probe in week 4:liner blood flow in synovial membrane, exceeded the half area and covered by colour signal.

圖4　AIA組與空白組滑膜厚度的對(duì)比Fig.4　AIA group compared with control group，synovial membranesNote: Synovial membrane AIA vs. Control with significant difference (GLM, Grenhous-Geisser 0.362, P<0.05).

表2模型組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病理分級(jí)

Tab.2Pathology grading in each biopsy

DaysGradeofpathology(n)Grade1Grade2Grade32818205601468400201050020

圖5　AIA組、空白組TNF-α、VEGF水平與空白組相應(yīng)指標(biāo)相比較Fig.5　AIA group compared with control group for TNF-α, VEGFNote: There is significance difference for TNF-α, VEGF between AIA group and control group. VEGF (GLM，Greenhouse-Geisser 0.286,P<0.05),TNF-α(Greenhouse-Geisser 0.289,P<0.05).

圖6　第4周，滑膜病理改變Fig.6　Week 4，pathology changing for synovial membranesNote: Lining cells hyperplasia, slight inflammatory infiltration(40×10).

圖7　第12周，滑膜病理改變Fig.7　Week 12，pathology changing for synovial membranesNote: Severe inflammatory infiltration with pannus formation (40×10).

表3超聲引導(dǎo)下滑膜活檢情況分析

Tab.3Analysis of ultrasound guided biopsy

WeeksSuccessFailurePostprocedurehaemorrhage,infectionandjointdamageWeek44000Week83640Week123730Week153910Total15280

圖8　滑膜厚度與VEGF相關(guān)性檢驗(yàn)Fig.8　Significant correlation between synovial membrane and VEGFNote: Pearson,R=0.869,P<0.05.

圖9　滑膜厚度與TNF-α水平的相關(guān)性檢驗(yàn)Fig.9　Significant correlation between membrane and TNF-αNote: Pearson,R=0.814,P<0.05.

表4病理評(píng)分與滑膜厚度、VEGF、TNF-α的Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)

Tab.4Spearman test of pathology score, membrane thickness, VEGF and TNF-α

PathologyscoreRPVEGF0.783<0.05TNF-α0.773<0.05Membranesthickness0.871<0.05

3討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎早期的臨床研究，由于患者就診時(shí)間常在關(guān)節(jié)炎癥狀出現(xiàn)之后，故難以在人類關(guān)節(jié)上觀察到關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的早期情況以及關(guān)節(jié)損傷從無到有的全過程。故有必要建立可靠的極早期關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。

選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究的基礎(chǔ)。因 Ⅱ 型膠原可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎性質(zhì)的自身免疫反應(yīng),故以 Ⅱ 型膠原免疫相應(yīng)動(dòng)物，可成功建立了膠原性關(guān)節(jié)炎的模型。Qiu等[3]的研究提示，當(dāng)8 mg的OVA注入兔子關(guān)節(jié)時(shí)，造模成功率達(dá)100%。同時(shí)該模型較為廉價(jià)，適合較大規(guī)模的飼養(yǎng)與造模。它的血清學(xué)、病理學(xué)改變均接近人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎?；谝陨峡紤]，同時(shí)為了滿足類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎超聲影像學(xué)研究對(duì)于關(guān)節(jié)空間分辨度的要求，我們選擇用兔子AIA模型作為該研究的基礎(chǔ)。

在以往的研究中，通常該模型在造模后8周，方開始進(jìn)行影像學(xué)、血清學(xué)的研究，但此刻該模型的關(guān)節(jié)炎改變已逐步進(jìn)入慢性化改變，不能反映該模型關(guān)節(jié)炎的早期病理生理改變。故該模型的早期病理、生理改變并沒有被充分研究。我們?cè)诖舜窝芯恐袑Ｗ⒂谟^察AIA模型建模后早期(前8周)關(guān)節(jié)炎的各種指標(biāo)。

在建造模型后8周內(nèi)，我們比較了對(duì)照組與AIA組中滑膜厚度、VEGF、TNF-α水平的改變，發(fā)現(xiàn)AIA組各的相應(yīng)指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組，而且滑膜厚度與血清學(xué)改變具有顯著相關(guān)性。在該組模型的第4周與第8周的病理切片也提示明顯的炎癥改變。我們以病理讀片作為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了滑膜與血清學(xué)、病理學(xué)相關(guān)性分析。結(jié)果提示，病理評(píng)分與滑膜厚度、血清VEGF、TNF-α與病理標(biāo)本的相關(guān)性顯著。說明該AIA模型可以反映早期的關(guān)節(jié)炎的病理生理變化。

在以往同類動(dòng)物研究中，為獲取病理標(biāo)本，往往采用處死模型動(dòng)物，解剖關(guān)節(jié)的方法；該方法可獲取完整的病理組織，但動(dòng)物死亡導(dǎo)致，無法在早期連續(xù)監(jiān)測(cè)模型動(dòng)物的病變情況。在近期Kelly等[12]的研究提示，超聲引導(dǎo)下的滑膜活檢作為微創(chuàng)的介入操作，可有效、安全的獲取滑膜病理組織，同時(shí)創(chuàng)傷較小、費(fèi)用低廉、操作人員較為容易培訓(xùn)，很適合用于動(dòng)物試驗(yàn)。因此該研究中我們采用超聲引導(dǎo)下滑膜活檢的方法，獲取滑膜病理標(biāo)本，驗(yàn)證了超聲引導(dǎo)下活檢的安全性、有效性。我們?cè)诳偣?60次的滑膜活檢中，僅因?yàn)槁樽砩疃葐栴}失敗8次，在全部的活檢后以目視與超聲的隨訪中，無一出現(xiàn)感染、術(shù)后出血、關(guān)節(jié)骨質(zhì)損傷的情況。故該結(jié)果提示，超聲引導(dǎo)下的滑膜活檢是AIA模型獲取病理組織安全、有效的手段。

該實(shí)驗(yàn)初期曾嘗試以CRP、ESR來反映關(guān)節(jié)炎性程度，但上述指標(biāo)易受外界因素影響，如關(guān)節(jié)活檢、麻醉、采血等，出現(xiàn)較大波動(dòng)，故最終排除出此次實(shí)驗(yàn)。

4結(jié)論

總之，通過超聲監(jiān)測(cè)的滑膜厚度、VEGF、TNF-α，病理標(biāo)本隨訪，卵清蛋白誘導(dǎo)的兔類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型可作為早期(8周前)關(guān)節(jié)炎病理生理改變的穩(wěn)定模型。超聲引導(dǎo)下的滑膜活檢可安全有效地獲取病理標(biāo)本，提高了病情隨訪的可靠性、持續(xù)性。

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[收稿2015-08-27修回2015-09-16]

(編輯張曉舟)

Early stage antigen-induced arthritis in rabbits:establishing and evaluation

ZHENGQing,CHENShu-Qiang,MIAOWei-Bing,ZHENGLing,CHENJing,CHENJun-Min.

FirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalCollege,Fuzhou350003,China

[Abstract]Objective:To evaluate early stages of arthritis in AIA model in vivo,by using high frequent PDUS,serum VEGF,TNF-α and pathology evaluation.We also estimate the feasibility and safety of US guided biopsy on AIA model,instead of animal sacrifice.Methods: 25 New Zealand white rabbits were randomized into 2 groups,20 in experimental group and 5 in contrast group. High-resolution ultrasound was used to evaluate arthritis.Serum VEGF and TNF-α were determined by ELISA.Ultrasound guided biopsy was applied and the pathological sections were observed by microscope and accessed.Results: (1)The thickness of membranes,VEGF,TNF-α in animal model group were significantly higher than those of control group(P<0.05).(2)In the early stage(4 weeks to 8 weeks)of AIA model,the thickness of membranes, serum VEGF and TNF-α were with correlation with patholology score(P<0.05).(3)The success rate of US-guided biopsy was 95% and no infection,heamorrhage and bony destruction were observed after these procedures.Conclusion: (1)AIA model can be used as a stable model for the early stage of antigen induced arthritis.(2)US-guided biopsy is safety and effective method to obtain synovial membranes.

[Key words]Rheumatoid arthritis；Animal model；Ultrasound；VEGF；TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.016

作者簡介：鄭擎(1981年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫學(xué)研究。

中圖分類號(hào)R593.22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0673-05

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

①本文為國家自然科學(xué)基金(No.81272628)、福建省自然科學(xué)基金(No.2015J01459)和福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院青年骨干教師基金(No.JGG201307)資助項(xiàng)目。

通訊作者及指導(dǎo)教師：陳君敏(1963年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫學(xué)、血液病學(xué)研究。