Smad4基因條件性敲除對T細胞發育的影響

丘桂華　張雪瑩　曹煥玲　趙亞偉　張紀巖

(廣西醫科大學研究生學院，南寧530021)

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Smad4基因條件性敲除對T細胞發育的影響

丘桂華張雪瑩①曹煥玲②趙亞偉③張紀巖

(廣西醫科大學研究生學院，南寧530021)

[摘要]目的：探討特異性地在T細胞中敲除Smad4基因后，對T細胞發育的影響。 方法：制備小鼠胸腺單細胞懸液，通過流式細胞術檢測表面標記分子CD4、CD8、TCRβ、NK1.1、γδT CR和核因子Foxp3的表達情況。 結果：Smad4在T細胞中的缺失不影響CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+ SP、CD8+ SP、TCRβhi、NK1.1+ TCRβ-、NK1.1+ TCRβ+、CD8-γδT +、CD8+γδT+、CD4+Foxp3+ nTreg等細胞亞群在胸腺細胞中的比例與絕對數。 結論：Smad4基因在T細胞中的條件性敲除不影響T細胞的發育。

[關鍵詞]T細胞;Smad4;發育;小鼠

Smad家族蛋白是TGF-β/Smad信號通路將胞外信號傳遞至胞內的一個重要家族蛋白，Smad家族蛋白包括Smad1至Smad8[1]。Smad4蛋白是其中之一，Smad4和Smad2、Smad3組成的三聚體介導了TGF-β I類受體的信號傳遞[2]。因而可以看出，Smad4在TGF-β信號通路中發揮了重要的作用。在T細胞中，TGF-β信號通路對其免疫功能發揮和維持起了重要的作用，部分機制在于影響nTreg的發育[3]，然而目前關于Smad4蛋白缺失對T細胞發育影響的研究卻很少。我們的研究主要的目的就是利用Smad4基因條件性缺失小鼠模型，探索Smad4對于T細胞發育的可能影響。鑒于Smad4完全敲除的小鼠由于外胚層形成的缺陷在胚胎早期就會死亡，我們引進了利用Cre-loxP系統的Smad4條件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)，與Lck近端啟動子驅動的Cre重組酶轉基因小鼠配種繁殖，獲得Smad4基因T細胞條件性敲除的小鼠(Smad4Cre/Co/Co)，同窩同性別的Smad4Co/Co小鼠作為對照。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物本實驗所使用的Smad4基因T細胞條件性敲除小鼠(Smad4Cre/Co/Co)和對照小鼠——Smad4條件基因打靶小鼠(Smad4Co/Co)均由軍事醫學科學院八所楊曉教授提供。小鼠飼養于軍事醫學科學院實驗動物中心SPF清潔實驗動物房。

1.1.2主要試劑動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物技術有限公司；PCR反應混合體系Taq 2×Mix購自TIANGEN公司；引物合成由北京諾賽基因公司完成；DNA電泳上樣緩沖液、DNA Marker (D2000 DNA Ladder) 購自北京索萊寶科技有限公司；透化液、固定液、各種熒光素標記的抗CD4、CD8等抗體以及同型抗體購自eBioscience公司；破紅液、FACS洗液等為本實驗室常規配制；Actin抗體購于北京中杉金橋公司；Smad4抗體購于Cell Signaling Technology公司；凝膠電泳及轉印設備購于Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取基因組的提取說明參照試劑盒說明書。

1.2.2聚合酶鏈式反應(PCR)PCR引物由北京諾賽基因公司合成，引物序列見表1。

PCR反應條件：94℃，1 min；68℃，80 s；72℃，30 s；94℃，2 min；94℃，30 s；60℃，30 s；72℃,1 min；30 cycles；72℃，8 min；4℃，保存。

1.2.3Western分析取小鼠胸腺后研磨制成單細胞懸液，細胞計數，取106/樣，RIPA裂解液冰上裂解15 min后，4℃ 13 000 r/min，15 min，取上清并調整蛋白濃度，最后加入4×loading buffer。煮沸10 min使其徹底變性。然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉3 h至PVDF膜上，5%脫脂奶粉(TBST溶解)室溫封閉1 h，相應條帶加入對應的Smad4或者β-actin抗體，4℃過夜，山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h。最后在膜上涂ECL顯影及曝光。

1.2.4表面標記分子染色及分析①取小鼠胸腺后研磨制成單細胞懸液，細胞計數，取106/樣，1 200 r/min 4 min；②取一定的FACS洗液(2% FBS，0.1% NaN3in PBS)重懸細胞，使染色的總體系為100 μl；③按照說明書要求每個樣品加入一定量的熒光標記的表面標記分子抗體或同型對照抗體，完成后混合均勻；④4℃避光放置30 min；⑤1 200 r/min 4 min離心去上清，加入FACS洗液1 ml/樣洗一遍，最后用200 μl的1%的多聚甲醛重懸后4℃放置或者立刻用流式細胞儀(Becton Dickinson FACSCalibu) 檢測分析。

1.2.5Foxp3染色及分析在收集細胞后用eBioscience公司fixation/permeabilization 試劑盒進行破膜固定，然后加入PE標記的Foxp3抗體，4℃避光放置30 min染色，洗滌后4℃放置或者立刻用流式細胞儀檢測分析。

2結果

2.1敲除小鼠的基因型鑒定在Smad4Cre/Co/Co小鼠體內如果Cre重組酶表達，將介導相同方向位于同一條染色體上的2個LoxP之間的基因重組，除去2個LoxP之間的外顯子8序列，在染色體上只保留1個LoxP位點，用引物Smad4-7，Smad4-10進行擴增可擴增出包含一個LoxP位點和部分外顯子9基因的234 bp的DNA片段。我們提取了鼠尾組織的基因組DNA，用特異性引物進行PCR的結果顯示：在Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中均可擴出被Flox錨定的片段；而只有Smad4Cre/Co/Co小鼠可以擴增出Lck-Cre片段，同時也能夠擴增出被Cre酶敲除的234 bp DNA片段(圖1)。因此在DNA水平上，可以認為我們引進的小鼠模型正確。

圖1　Smad4Co/Co小鼠與Smad4Cre/Co/Co小鼠基因型鑒定Fig.1　Phenotype analysis of Smad4Co/Co mice and Smad4Cre/Co/Co mice

表1引物序列

Tab.1Primer sequence

GenotypePrimersequenceLengthLck-Cre5'-TGGGAGGCAGGAAGTGGGTAACTAGACTAA-3'420bp5'-GAAGATAATCGCGAACATCTTCAGG-3'AnchorbyfloxSmad4-95'-GGGCAGCGTAGCATATAAGA-3'WildtypeSmad4gene385bp;anchorbyloxPSmad4gene438bpSmad4-105'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'DeletebyCreenzymeSmad4-75'-CCTTAGTTGAAGCTTATAACTTCG-3'Exon8ofSmad4gene,234bpSmad4-105'-GACCCAAACGTCACCTTCAC-3'

2.2敲除小鼠的Western鑒定Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺細胞Western分析顯示，在Smad4Co/Co小鼠的胸腺細胞中能夠檢測到Smad4蛋白表達，而在Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺細胞中，Smad4蛋白不表達(圖2)。所以在蛋白水平上，可以認為我們引進的小鼠模型正確。

2.3Smad4缺失對T細胞發育的影響Lck近端啟動子在T細胞發育的早期即雙陰性階段即開始發揮作用[4]，于是我們首先分析的Smad4缺失是否影響γδT細胞發育經歷雙陰性階段、雙陽性階段和單陽性階段、TCRβ表達增強、nTreg生成的過程。為了防止繼發的炎癥反應對T細胞發育的可能影響，我們利用7天大新生小鼠進行了分析，在這個時間點，胸腺內T細胞發育均已完成并且已經生成nTreg[5]。我們對胸腺細胞進行了CD4/CD8和CD4/Foxp3染色分析，發現Smad4缺失不影響CD4-CD8-DN(Co/Co:8.4%±1.5% vs Cre/Co/Co：9.5%±1.7%)、CD4+CD8+DP (Co/Co：76.9%±5.7% vs Cre/Co/Co：73.6%±5.7%)、CD4+SP(Co/Co:9.2%±3.6% vs Cre/Co/Co：10.3%±4.7%)、CD8+SP(Co/Co：5.5%±1.4% vs Cre/Co/Co：6.6%±0.9%)和CD4+Foxp3+ nTreg(Co/Co：0.36%±0.06% vs Cre/Co/Co：0.4%±0.07%)亞群的比例。T檢驗結果顯示，以上細胞亞群比例在統計學上沒有差異(圖3A、B)。我們還計算了上述細胞亞群的絕對數，發現Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中上述細胞亞群的絕對數也沒有統計學差異(圖4A、B)。

圖2　Western分析小鼠胸腺細胞中Smad4蛋白表達水平Fig.2　Western analysis of Smad4 expression in thymocytes

圖3　 Smad4Co/Co與Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺各亞群細胞的比例(n=6)Fig.3　Subset percentages of Smad4Co/Co and Smad-4Cre/Co/Co thymocytes(n=6)Note: A.Representative data of CD4 and CD8 staining;B.Representa-tive data of CD4 and FoxP3 staining;C.Representative data of γδT CR and CD8 staining;D.Representative data of NK1.1 and TCRβ staining.

2.4Smad4缺失對其他在胸腺內發育的淋巴細胞亞群的影響除了γδT細胞，部分γδT 細胞、NKT細胞和少量NK細胞的發育也在胸腺中完成，并且其發育的時間點在雙陰性階段之后[6-8]。因此，我們還對胸腺細胞進行了NK1.1/ TCRβ、CD8/γδT CR染色分析，發現Smad4缺失不影響CD8-γδT+(Co/Co:0.6%±0.05% vs Cre/Co/Co:0.6%±0.02%)、CD8+γδT+(Co/Co:0.57%±0.25% vs Cre/Co/Co:0.55%±0.08%)、NK1.1+TCRβ-(Co/Co:1.6%±0.02% vs Cre/Co/Co:1.4%±0.3%)、NK1.1+TCRβ+(Co/Co:0.57%±0.028% vs Cre/Co/Co:0.41%±0.16%)亞群的比例。T檢驗結果顯示，以上細胞亞群比例在統計學上沒有差異(圖3C、D)。 我們還計算了上述細胞亞群的絕對數， 發現Smad4Co/Co和Smad4Cre/Co/Co小鼠中上述細胞亞群的絕對數也沒有統計學差異(圖4C、D)。

圖4　Smad4Co/Co與 Smad4Cre/Co/Co小鼠胸腺各亞群細胞的絕對數(n=6)Fig.4　Total number of thymocytes subsets in Smad4Co/Co and Smad4Cre/Co/Co mice respectively(n=6)Note: A.Total number of CD4+ SP,DP,DN,CD8+ SP thymocytes and its P value；B.Total number of CD4+FoxP3+ (nTreg) thymocytes and its P value.C.Total number of γδT+CD8- and γδT+CD8+ thymocytes and its P value.D.Total number of NK1.1+ TCRβ- and NK1.1+TCRβ+ thymocytes and its P value.

3討論

Smad4是TGF-β信號轉導通路中的一個重要分子，Smad4和Smad2、Smad3共同介導TGF-β I類受體的信號傳遞。研究表明TGF-β在細胞分化、增殖、免疫抑制等諸多方面發揮了重要作用[3,9,10]。TGF-β能夠通過促進Foxp3的表達從而促進Treg的發育[3]。Smad4與TGF-β信號通路的關系密切，我們推測Smad4蛋白可能在這些免疫細胞的發育成熟過程也起著同樣的作用。通過對一系列的表面分子的流式分析，結果發現Smad4在T細胞中的條件性缺失對CD4、CD8和Treg細胞的發育并無顯著影響，并且也不影響其他在胸腺中發育的淋巴細胞亞群。我們的結果說明，TGF-β對T細胞的發育的影響不依賴于Smad信號轉導途徑。

有研究者發現[11]，TGF-β介導T細胞的功能并不完全依賴于Smad家族蛋白，也存在著獨立于Smad蛋白的途徑，這些途徑包括MAPKs，Rho-like GTPases或PI3K[12]。我們以前的發現提示MAPKs家族成員可能對Foxp3表達有重要影響[13]，可能MAPKs途徑通過JNK或ERK對Foxp3表達產生影響，進而影響Treg細胞的發育。除此之外，研究發現[14,15]，降低活性的Akt促進了Treg細胞的發育，過表達的Akt抑制了Treg的發育，因而，Treg細胞的發育不是通過PI3K信號途徑。那么會是通過Rho-like GTPases的途徑嗎？目前并沒有關于這方面的報道，所以暫時無法判斷這一通路在TGF-β誘導Foxp3表達中的作用。

4致謝

感謝軍事醫學科學院生物工程研究所楊曉研究員和蘭雨研究員提供的小鼠，同時感謝本實驗室其他同事給予的幫助與指導。

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[收稿2015-09-25修回2015-11-17]

(編輯許四平)

Effects of conditional deletion ofSmad4 gene on T cell development

QIUGui-Hua,ZHANGXue-Ying,CAOHuan-Ling,ZHAOYa-Wei,ZHANGJi-Yan.

GuanxiMedicalVniversityGraduateSchool，Nanning530021，China

[Abstract]Objective:To study the role of Smad4 in T cell development.Methods: Single cell suspension of thymus was prepared and the expression of CD4，CD8，TCRβ，NK1.1，γδT CR and nuclear factor Foxp3 was examined by flow cytometry.Results: The percentages and absolute numbers of CD4-CD8-，CD4+CD8+，CD4+ SP，CD8+ SP，TCRβhi，NK1.1+TCRβ-，NK1.1+TCRβ+，CD8-γδT+，CD8+γδT+ CD4+Foxp3+ nTreg subsets remained unchanged in the absence of Smad4.Conclusion: Conditional deletion of the Smad4 gene does not affect T cell development.

[Key words]T cells;Smad4;Development;Mice

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.008

作者簡介：丘桂華(1989年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫炎癥信號轉導方向的研究，E-mail:ghqiu09@163.com。通訊作者及指導教師：張紀巖(1972年-)，女，博士，研究員，主要從事免疫炎癥信號轉導方向的研究，E-mail:jiyanzhang@hotmail.com。

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0640-04

①軍事醫學科學院基礎醫學研究所免疫學研究室，北京100850。

②河南大學研究生學院，鄭州475001。

③河南省漯河市中心醫院風濕科，漯河462000。