中國(guó)AML人群CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變發(fā)生率檢測(cè)*

廖長(zhǎng)風(fēng)，劉禮平，賴文鴻，林傳明，李海亮

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，江西　贛州　341000)

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中國(guó)AML人群CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變發(fā)生率檢測(cè)*

廖長(zhǎng)風(fēng)，劉禮平，賴文鴻，林傳明，李海亮

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，江西贛州341000)

摘要：目的：回顧性分析大量病例的基因檢測(cè)結(jié)果，闡述CEBPa、NPM1及FLT3-ITD這三種最常見(jiàn)的AML突變基因在中國(guó)人群中的發(fā)生率。方法：本研究總共從全國(guó)25家醫(yī)院收集了878例AML成年患者的標(biāo)本(包括骨髓和外周全血)的CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變檢測(cè)的結(jié)果。結(jié)果：共檢測(cè)出103例(11.7%)CEBPA基因突變，79例(9.0%)NPM1基因突變，以及71例(8.1%)FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性患者。在71例ITD基因突變陽(yáng)性患者中，29例(40.8%)患者同時(shí)檢測(cè)到NPM1基因突變陽(yáng)性，12例(16.9%)患者同時(shí)有CEBPA基因突變。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)AML人群中CEBPA、NPM1和FLT3-ITD基因突變的發(fā)生率和國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)有所不同，為進(jìn)一步探索其潛在原因提供了初步的數(shù)據(jù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：突變基因；急性髓系白血病；發(fā)生率；中國(guó)

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是髓系原始細(xì)胞克隆性增生疾病，是造血前體細(xì)胞發(fā)生的一系列基因改變的結(jié)果。這些變化會(huì)引起造血細(xì)胞發(fā)生和分化的異常，從而導(dǎo)致大量不成熟的髓樣細(xì)胞在骨髓和外周血中的出現(xiàn)和積累。這些異常細(xì)胞能夠分裂和增殖，但不能分化成成熟的血細(xì)胞(即嗜中性粒細(xì)胞)。基因測(cè)序研究表明，原發(fā)性AML病例平均包含超過(guò)10個(gè)顯著的基因突變。其中最常見(jiàn)的突變基因包括：FLT3(28%)，NPM1(27%)，DNMT3A(26%)，IDH1或IDH2(20%)，NRAS或KRAS基因(12%)，RUNX1(10%)，TET2(8%)，TP53(8%)，CEBPA(6%)和WT1(6%)。確定突變基因?qū)ε袛郃ML患者的預(yù)后有相當(dāng)?shù)囊饬x，并且影響治療計(jì)劃的選擇[1]。本研究課題回顧性的分析了在878名AML患者中三種基因突變的發(fā)生情況，包括CEBPA (CCAAT enhancer-binding protein alpha)、NPM1 (Nucleophosmin)和FLT3-ITD(Fms-like tyrosine kinase 3-Internal tandem duplications)。

1材料和方法

1.1研究對(duì)象從2012年8月到2014年4月，我們回顧性研究了來(lái)自于全國(guó)25家醫(yī)院急性髓系白血病(AML)成年患者的標(biāo)本(包括骨髓和外周全血)的CEBPa、NPM1、FLT3-ITD基因突變檢測(cè)的結(jié)果。AML的診斷依據(jù)血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)第三版[2]。

1.2基因組 DNA 的制備取患者初診時(shí)凍存的骨髓或外周血2～3 mL。采用DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品)提取基因組DNA，測(cè)定吸光度A260 nm/A280 nm值確定DNA產(chǎn)物的濃度，用去離子水稀釋基因組DNA樣品至50～150 ng·μL-1。

1.3PCR 擴(kuò)增

1.3.1CEPBa基因擴(kuò)增PCR 總體系 20 μL ，包括模板 DNA 3 μL、擴(kuò)增反應(yīng)液17 μL (上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司相關(guān)基因檢測(cè)產(chǎn)品)。PCR條件：42 ℃ 5 min；94 ℃，5 min；(94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；產(chǎn)物4 ℃保持。反應(yīng)液A的擴(kuò)增片段大小在570 bp，反應(yīng)液B的擴(kuò)增片段大小在675 bp。

1.3.2FLT3-ITD和NPM1基因擴(kuò)增PCR 總體系25 μL，包括模板DNA 3 μL、 擴(kuò)增反應(yīng)液22 μL(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司相關(guān)基因檢測(cè)產(chǎn)品)。PCR條件：42 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min (94 ℃ 15 s；60 ℃ 25 s；72 ℃ 1 min)40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；產(chǎn)物4 ℃保持。FLT3-ITD基因擴(kuò)增片段大小450 bp，NPM1基因擴(kuò)增片段大小250 bp。

1.4基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析使用測(cè)序產(chǎn)物純化試劑及測(cè)序試劑(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品)對(duì)擴(kuò)增符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶解、測(cè)序PCR及純化。酶解PCR反應(yīng)體系7 μL: PCR產(chǎn)物5 μL+2 μL SAP，混勻；PCR條件:37 ℃ 60 min;80 ℃ 15 min;產(chǎn)物 4 ℃存。測(cè)序PCR反應(yīng)體系6 μL:PCR 酶解產(chǎn)物3 μL+1 μL測(cè)序劑(bigdye) +2 μL測(cè)序引物;PCR條件:96 ℃ 1 min(96 ℃ 10 s;50 ℃ 5 s;60 ℃ 4 min)30個(gè)循環(huán);產(chǎn)物4 ℃保存。測(cè)序產(chǎn)物純化采用標(biāo)準(zhǔn)的酒精/EDTA/NaAc法，用Applied Biosystems 3130測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司中國(guó)公司)通過(guò)毛細(xì)管電泳對(duì)純化好的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果。分別檢測(cè)NPMl基因第12外顯子基因的插入、FLT3-lTD基因第14和15號(hào)外顯子基因的插入及CEBPa基因的插入缺失突變情況。

2結(jié)果

2.1一般資料本研究總共從全國(guó)25家醫(yī)院收集了878例AML成年患者的標(biāo)本(包括骨髓和外周全血)的CEBPA、NPM1、FLT3-ITD基因突變檢測(cè)的結(jié)果。其中男性患者582名(66.3%)，女性患者296名(33.7%)。平均年齡64.1歲(20歲到79歲)。

2.2CEBPA、NPM1及FLT3-ITD基因突變測(cè)序的結(jié)果878例AML病例中，共檢測(cè)出103例(11.7%)CEBPA基因突變陽(yáng)性患者，79例(9.0%)NPM1基因突變陽(yáng)性患者，71例(8.1%)FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性患者。在71例ITD基因突變陽(yáng)性患者中，29例(40.8%)患者同時(shí)檢測(cè)到NPM1基因突變陽(yáng)性，12例(16.9%)患者同時(shí)有CEBPA基因突變。有兩個(gè)基因突變陽(yáng)性的患者占到總患者人群的4.7%(41例)見(jiàn)圖1。

箭頭所示為突變發(fā)生的位點(diǎn)。

3討論

FLT3是一種跨膜的絡(luò)氨酸酶受體，它的激活會(huì)刺激細(xì)胞的增殖。FLT3基因突變已經(jīng)被公認(rèn)為AML中發(fā)生率最高的一種基因改變，其中最常見(jiàn)的突變?yōu)閮?nèi)部串聯(lián)復(fù)制 (FLT3-ITD)。FLT3-ITD的突變以及其導(dǎo)致的FLT3受體絡(luò)氨酸激酶的激活在AML患者中非常常見(jiàn)，特別是在正常核型的患者中[3]。FLT3-ITD 為FLT3突變的主要表現(xiàn)形式，國(guó)外報(bào)道FLT3-ITD在 AML 中的發(fā)生率約為 20%[3-5]，而在 AML-NK 中突變頻率為 28%～34%[6]。本研究AML患者中FLT3-ITD檢測(cè)的突變率為8.1%，低于國(guó)內(nèi)其他報(bào)道[7]，可能本研究樣本來(lái)自于多地區(qū)中心人群相關(guān)，各地區(qū)樣本量的不均一可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出的突變率有差異，更大樣本量及分區(qū)域的數(shù)據(jù)分析能協(xié)助了解區(qū)域性差異。FLT3-ITD的突變和兒童和年輕AML患者的較差的預(yù)后有直接相關(guān)，同時(shí)與接收高密度化療的老年患者的較差的預(yù)后也密切相關(guān)[8-12]。Marcucci和Schlenk的研究分別發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3-ITD的AML患者，其2年無(wú)病生存率和4年總體生存率均為20%[9，13]。

核仁磷酸蛋白 (Nucleophosmin gene) NPM1 是一種廣泛表達(dá)的磷蛋白，通常穿梭于細(xì)胞核和胞質(zhì)之間，參與核糖體蛋白的組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)，以及腫瘤抑制基因ARF的調(diào)控[14]。NPM1基因位于第5號(hào)染色體 q35[14]，其基因突變是急性髓系白血病的一種特異性表現(xiàn)，其發(fā)生率在正常核型的成人急性髓系白血病(AML-NK)患者中約為50%～60%[15]。NPM1基因突變通常與更好的AML預(yù)后相關(guān)[16]。 伴有NPM1基因突變的患者對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的緩解敏感，因此Schnittger等提出可以將NPM1突變陽(yáng)性作為預(yù)測(cè)AML的預(yù)后良好的指標(biāo)之一[17]。

CEBPA基因編碼CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha)，一種粒細(xì)胞分化因子，是轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要成員，在髓系分化中起著重要作用[18-19]。CEBPA在AML中的發(fā)生比例約為5%～14%[20]。本研究檢測(cè)的AML人群中CEBPA突變的發(fā)生為11.7%，與先前的中國(guó)人群研究一致[21-22]。CEPBA突變可分為2種形式：(1)C-端發(fā)生突變對(duì)基本區(qū)域進(jìn)行干擾，進(jìn)而影響DNA結(jié)合。該突變形式存在于大多數(shù)AML患者中；(2)N-端突變，由于不能形成完整的42 KD蛋白質(zhì)，因此引發(fā)細(xì)胞增殖[23]。目前研究表明，CEBPA 基因突變可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后良好的指標(biāo)[23]，在AML的患者中，與CEBPA沒(méi)有突變的患者相比， CEBPA突變的患者總生存期較長(zhǎng)[20，24]。還有研究表明，若有兩種基因同時(shí)發(fā)生突變，對(duì)AML患者的預(yù)后將會(huì)發(fā)生較大的影響[24]。

在本研究中，我們?cè)贏ML患者中共檢測(cè)出4.7%的病例(41例)有兩個(gè)基因的突變，其中包括29名患者同時(shí)檢測(cè)到FLT3-ITD和NPM1基因突變陽(yáng)性，以及12例患者同時(shí)有FLT3-ITD和CEBPA基因突變。NPM1 突變經(jīng)常同F(xiàn)LT3-ITD突變一起發(fā)生，很少伴隨其他突變發(fā)生，并且NPM1+/FLT3-ITD患者的預(yù)后良好，提示NPM1+是NK-AML患者獨(dú)立的良好預(yù)后因素[25]。但研究表明，伴有FLT3-ITD陽(yáng)性的患者 NPM1突變不能改變其不良的預(yù)后[26]。而CEBPA突變患者往往同時(shí)存在FLT3-ITD突變[24]，F(xiàn)LT3-ITD突變能夠降低患者的總生存期，因此單純CEBPA突變的AML患者預(yù)后較好，若同時(shí)伴隨FLT3-ITD突變，將會(huì)影響AML患者對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的緩解效果，預(yù)后仍然不佳[26]。

本回顧性研究對(duì)多中心和大量病例的基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析，闡述了CEBPA、NPM1及FLT3-ITD這三種最常見(jiàn)的AML突變基因在中國(guó)人群中的發(fā)生率。

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Detection of Gene Mutation Rate of CEBPa, NPM1 and FLT3-ITD in Patients with Acute Myeloid Leukemia in China

LIAOChang-feng,LIULi-ping,LAIWen-hong,LINChuan-ming,LIHai-liang

(Dept.ofInternalMedicineofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,Ganzhou,Jiangxi341000)

Abstract:Objective:To analyze retrospectively the results of gene detection in a large number of cases and to describe the incidence of gene mutation of CEBPa, NPM1 and FLT3-ITD, three most common AML mutations, in the Chinese population. Methods:CEBPa,PM1,FLT3-ITD mutation detection in adult patients of 878 cases with AML were collected from 25 hospitals.Results:103 cases (11.7%) of CEBPA mutations,79 cases (9%) of NPM1 mutations, and 71 cases (8.1%) of FLT3-ITD mutation were detected to be positive. In the 71 positive ITD mutation patients, 29(40.8%) patients were simultaneously detected NPM1 mutation, and 12 patients (16.9%) had CEBPA mutation simultaneously. Conclusion:This study found CEBPA, NPM1, FLT3 gene mutation in Chinese AML population occurrence rate vary from the data reported in foreign literature. This provides preliminary data for further exploration of the underlying cause.

Key words:mutation gene;acute myeloid leukemia;incidence;China

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：20155410)

通訊作者：李海亮，男，學(xué)士，主任醫(yī)師，從事血液病研究。E-mail:gyfylhl@163.com

中圖分類號(hào)：Q754

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-5779(2016)02-0208-04

DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2016.02.013

(收稿日期：2015-07-15)(責(zé)任編輯：敖慧斌)