磷酸改性花生殼固定化α-淀粉酶研究

廖曉峰，于榮，梁華正，嚴根華（東華理工大學，江西南昌330038）

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磷酸改性花生殼固定化α-淀粉酶研究

廖曉峰，于榮*，梁華正，嚴根華
（東華理工大學，江西南昌330038）

摘要：以磷酸改性花生殼為載體固定α-淀粉酶，研究改性后的花生殼吸附固定α-淀粉酶的最優固定化條件以及固定化酶的酶學性質。試驗結果表明：用磷酸溶液對粉碎的花生殼顆粒進行浸泡處理來改性，研究出酶固定化最優條件是：酶液/載體比11∶1（mL/mg），緩沖液pH6.0，固定時間8h和溫度35℃。經3次平行試驗，所得實際固定化酶活力平均值為27 980 U/g。對游離酶和固定化酶部分酶學性質比較，得出改性固定化后酶的最適反應pH、溫度有所改變，為pH= 6.0，溫度45℃，其儲存時間、操作穩定性和耐熱性比游離酶更好。

關鍵詞：改性花生殼；固定化酶；磷酸

固定化酶技術既指用固體材料將酶束縛在一定的密閉空間內，能連續地進行反應，反應后的酶可以回收重復使用的一類技術。酶的固定方法分主要分為化學和物理方法，化學方法為交聯法和共價法，物理方法為吸附法和包埋法共4大類［1-4］：吸附法、包埋法、交聯法和共價法。共價法是利用酶蛋白分子上的官能團和固定化載體表面上的基團反應形成共價鍵而使酶固定化的的方法，α-淀粉酶表面上有多種可利用的化學基團，比如羥基、巰基等，本論文α-淀粉酶的固定化就是使用這一技術。

我國是一個農業大國，也是花生生產大國，花生年產量達到1 500萬t，為世界第一，占全球花生產量的2/5以上。在花生加工過程中會產生大量的花生殼廢棄物，我國每年產生的花生殼廢棄物高達500萬t之多［5］。

共價法通常是指用化學試劑對花生殼顆粒進行活化處理，不僅可以改善花生殼的孔狀結果，還可以增加花生殼上的官能團數量，增強花生殼的吸附能力。活化花生殼常用的化學試劑有：檸檬酸、飽和KOH、磷酸、硫酸等［6-10］。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

1.1.1儀器

試驗儀器見表1。

1.1.2實驗試劑

試驗試劑見表2。

表1　試驗常用儀器Table 1 The mainly used equipments in the experiment

表2　試驗試劑Table 2 The real test reagents

1.1.3試驗原料

α-淀粉酶：上海藍季發展有限公司；花生殼：產地南昌。

1.2原料處理

1.2.1花生殼

將花生殼剪碎，直徑1 mm～2 mm大小，然后與蒸餾水充分混勻，浸泡24 h，過濾掉懸浮細小物質，在45℃下烘干備用。

1.2.2花生殼改性

稱取10 g未改性已烘干的花生殼粉置于500 mL的燒杯中，加入100 mL 1 mol/L的磷酸緩沖液溶液，攪拌8 h后，抽濾去除液體部分，在45℃下烘干，用蒸餾水清洗，在45℃下烘干后備用。

1.3測定方法

1.3.1淀粉酶活力的測定方法

α-淀粉酶的酶活力定義：在45℃，pH 5.6磷酸緩沖液的條件下，每反應15 min消耗1 mg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U/g）［8］。

游離酶的酶活力測定方法：將2%的可溶性淀粉溶液100 μL作為底物放入燒杯中，加入pH 5.6的1 mol/L醋酸緩沖液100 μL和400 μL蒸流水的混合溶液，隨后加入1 g的α-淀粉酶，混勻后置于45℃的水浴鍋中準確反應15 min，反應后立即加入0.1 mol/L的鹽酸1.0 mL終止反應。取反應液1.0 mL放入10 mL的比色管中，加入1.0 mL稀碘液后用蒸流水定容至10.0 mL，放在540 nm波長下比色。以相同量的淀粉酶和蒸餾水溶液為對照組，根據多糖標準曲線計算出反應消耗的葡萄糖的量。取3次的平均值為最終結果值［8］。

固定化酶的酶活力測定方法：試驗方法同上述游離酶的酶活力測定方法，取一定量的固定化酶溶液經過適當的稀釋替換以上的游離α-淀粉酶。測定是以3次結果為平均值。酶的相對酶活是指：在同一組試驗中，以活性最高的一組為100%，其余的酶活力與之相比，結果以百分數表示。

1.3.2可溶性淀粉溶液中多糖含量的測定方法

1.3.2.1葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線的繪制方法：分別精確吸取2.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.00、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mL和蒸餾水2.00、1.60、1.40、1.30、1.20、1.10、1.00 mL，配制成濃度為0.4 mg/mL～1.0 mg/mL的葡萄糖標準系列。分別吸取0.5 mL上述葡萄糖標準液于10 mL的比色管中，加入1.0 mL DNS試劑，沸水浴5 min。待溶液冷卻至室溫后，用蒸館水定容至10 mL，搖勻后放在540 nm波長下比色，以葡萄糖含量為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，算出標準線性回歸方程。（Y=AX+B）

反應后的樣品在室溫下放置15 min，若出現渾濁現象則放在3 000 r/min的離心機離心10 min，以上清液以標準空白調零，在540 nm波長處測定樣品空白A和樣品溶液B的吸光值，B-A為實際吸光值。用直線回歸方程計算樣品α-淀粉酶的活性。

1.3.2.2淀粉酶活力U

淀粉酶活性U按下式計算：

式中：U為樣品淀粉酶活性，U/mL；K為標準曲線斜率；F為樣品溶液的總量，mL；S為樣品測試量；式中S為1 mL；60為1 h為60 min；15為反應時間，min。

固定化酶的酶活力和改性之后的測定方法：試驗方法同上述游離酶的酶活力測定方法，測定時做3次平行試驗，結果取其平均值。

1.4固定化α-淀粉酶的單因素條件試驗

1.4.1酶液/載體比的確定

取6個三角瓶，在緩沖液pH6.0，固定溫度35℃，固定時間5 h條件下，按酶液/載體（mL/mg）分別為2∶1、5∶1、8∶1、11∶1、14∶1和17∶1的配比進行固定，分別用去蒸餾水洗滌3次，過濾抽干，檢測固定化酶活力。

1.4.2固定化時間對酶固定化活性的影響

取6個三角瓶，分別加入9 mL酶液和1 g改性花生殼，于35℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中，分別固定4、6、8、10、12、14 h，固定完成后，抽干過濾，用蒸餾水洗滌濾紙上的固定化酶3次，晾干，測定固定化酶活力。

1.4.3固定化溫度的選擇

取6個三角瓶，分別加入9 mL酶液和1 g改性花生殼，分別置于25、30、35、40、45、50℃，120 r/min恒溫振蕩搖床內固定6 h，固定完成后抽干過濾，根據葡萄糖標準曲線測出酶的活力。

1.4.4緩沖液pH對酶固定化的影響

用不同pH的磷酸緩沖液將α-淀粉酶液分別配成pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的酶液。取6個三角瓶，分別加入9 mL酶液和1 g改性花生殼，于35℃、120 r/min恒溫振蕩搖床中固定6 h，固定完成后的處理步驟同上，根據葡萄糖標準曲線測出酶的活力。1.5改性花生殼固定化a淀粉酶的酶學性質［9-10］

1.5.1游離酶與固定化酶酶最適pH比較

在酶的固定化溫度為35℃、固定化時間為6 h、及固定化酶用磷酸鹽緩沖液的pH為6.0的情況下，測定的固定化葡萄糖氧化酶的活性為100。

游離酶最適反應pH的測定方法：取1 g游離酶和固定化酶，按照酶活力測定的方法在體系中分別加入pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的1 mol/L的緩沖液100 μL，將配制好的體系置于35℃的水浴鍋中準確反應15min，而后分別計算出其相對酶活力。每組試驗設置3次平行試驗。

1.5.2游離酶與固定化酶的最適溫度比較

分別將游離酶與固定化酵在25、35、45、55、65、75℃的水浴鍋中進行反應，分別測定游離酶與固定化酶的相對酶活力。每組試驗設置3次平行試驗。繪制出游離酶和固定化酶在不同溫度條件下的相對酶活力曲線。比較游離酶與固定化酶的最適反應溫度是否發生改變。

1.5.3固定化酶的貯藏穩定性

將游離酶和固定化好的酶儲存在4℃冰箱4、8、12、16、20、24、28 d，分別測定各自的酶活力以及計算出酶相對活力。比較兩者的儲存穩定性。

1.5.4固定化酶的操作穩定性

將游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶在pH=6的緩沖液，溫度35℃與2%淀粉溶液反應15 min，反應后過濾抽干，繼續使用反應。總共反應6次，分別測出酶活力和相對酶活力。

2　結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖的標準曲線繪制見表3。葡萄糖的標準曲線見圖1。

表3　葡萄糖的標準曲線繪制Table 3 Draw the standard curve of glucose

圖1　葡萄糖的標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2改性花生殼固定α-淀粉酶的單因子試驗

2.2.1酶液/載體比對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力的影響

按不同的酶液/載體比對改性花生殼固定α-淀粉酶活力的影響見圖2。

圖2　不同酶液/載體比對酶活力影響Fig.2 Different enzyme/carrier ratio effect on the enzyme activity

從圖2中可以看出隨著酶液/載體的增大，固定化酶的相對活力呈先增大后減小的趨勢，但之后下降的趨勢變小，總體上保持不變，當酶液/載體為11∶1（mL/mg）時，固定化酶活力最高。這是因為固定化載體可吸附的酶量是有限的，當固定化載體相對較少時，可能由于每個載體分子表面吸附的蛋白量相對過多，造成酶分子相互聚集成團，酶分子的活性中心有可能被遮蓋，因此，酶液/載體的較適值為11∶1（mL/mg）。

2.2.2緩沖液pH對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力影響

在不同的pH環境中改性花生殼固定α-淀粉酶的結果見圖3。

圖3　緩沖液pH對酶活力的影響Fig.3 pH corresponds to the impact of enzyme activity

從圖3中可以看出，緩沖液pH不同，固定化酶活力也不同。當緩沖液pH為6.0時，固定化酶活力相對較高；改性花生殼在酸性環境中固定α-淀粉酶好于在堿性環境中固定α-淀粉酶。原因是酸性緩沖液可以改變酶分子和固定化載體的離子化狀態，另外酶作為一種蛋白質，當溶液pH超出一定范圍時，微觀結構會發生變化，從而引起酶變性失活。因此緩沖液pH是影響固定化α-淀粉酶催化活力的重要因素，最適值在6.0。

2.2.3固定化時間對改性α淀粉酶活性的影響

固定時間對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力的影響，結果見圖4。

圖4　固定化時間對酶活力的影響Fig.4 Immobilization of time corresponding to the enzyme activity

從圖4中可以看出，固定時間也是影響固定化酶活力的因素之一，α-淀粉酶和載體結合需要一段時間，但是并不是時間越長越好，這是因為α-淀粉酶為蛋白質，時間越長會導致部分活力損失。所以，改性花生殼固定α-淀粉酶的時間為8 h左右。

2.2.4固定化溫度對α淀粉酶活性的影響

固定化溫度對改性花生殼固定化α-淀粉酶活力的影響結果見圖5。

圖5　不同固定化溫度對酶活力的影響Fig.5 Effect of different immobilized on the enzyme activity

從圖5中可以看出，固定化酶活力隨著溫度上升活力升高，在35℃達到最高值29 700 U/g，之后隨著溫度上升活力下降，可以看出之后的下降速度明顯較快。因此α-淀粉酶的固定化溫度因為35℃。在40℃以后酶活力就由于高溫開始失活。

2.3改性花生殼固定化α-淀粉酶的酶學性質

2.3.1游離酶與固定化酶酶最適pH比較

在酶的固定化溫度為35℃、固定化時間為6 h、及固定化酶用磷酸鹽緩沖液的pH為6.0的情況下，測定的固定化酶的活性為100（酶活力為：29 950 U/g）見表4。

表4　不同pH對游離酶和固定化酶相對酶活的影響Table 4 pH corresponds to a different free enzyme and the relative activity of the immobilized enzyme

從表4可以看出不同pH有不同的酶活力，從游離酶和固定化酶相對酶活力可以看出，pH在6之前一直升高，在6之后就逐漸下降，游離酶最適pH=6.0，最高活力為29 100 U/g左右；固定化酶最適pH為6.0，最高酶活力為30 000 U/g左右。

2.3.2游離酶與固定化酶最適反應溫度比較

不同溫度對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響見表5。

表5　不同溫度對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響Table 5 Corresponding to the free enzyme at different temperatures and relative activity of the immobilized enzyme

從表5中可以看出游離酶和固定化酶最適反應溫度分別在40℃和45℃左右。游離酶在45℃之后相對酶活性下降較快而固定化酶下降較緩慢。固定化酶在75℃還能保持66.8%。游離酶卻只有28.4%左右。可能是因為改性固定化后改變了α-淀粉酶的內部結構使得酶的熱耐受力較強，因此可以看出固定化酶熱穩定性較好。

2.3.3固定化酶的貯藏穩定性

不同儲存時間下對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響見表6。

表6　不同儲存時間下對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響Table 6 Different storage time relative activity of the free enzyme and immobilized enzyme

游離酶在放置一周后酶活下降的幅度較大，在28 d后酶活性保持在57.8%左右，而改性固定化α-淀粉酶相對酶活在28 d后還保持在78%。可知固定化α-淀粉酶的儲存穩定性較好。

2.3.4固定化酶的操作穩定性

不同操作次數對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響見表7。

表7　不同操作次數對游離酶和固定化酶的相對酶活的影響Table 7 Different operating frequency corresponds to the free enzyme and the relative activity of the immobilized enzyme

操作穩定性可以從固定化酶的連續使用效果看出。如果制備的固定化酶在操作2到3次以后其酶活力就大幅度下降，那么固定化酶就失去了一定應用價值。由表7可以看出，固定化α-淀粉酶的酶活力隨著使用次數的增加呈下降的趨勢，但是下降的幅度較緩慢，連續進行6次操作以后，固定化α-淀粉酶的相對酶活仍然可以保持在第一次酶活力的71.4%，相比游離酶在操作6次后55.1%而言，固定化α-淀粉酶具有良好的操作性。

3　結論

本研究以磷酸改性花生殼為載體固定α-淀粉酶，研究了改性后的花生殼吸附固定α-淀粉酶的最優固定化條件以及固定化酶的一些酶學性質。試驗結果表明：用磷酸溶液對粉碎的花生殼顆粒進行浸泡處理進行改性，研究出酶固定化最優條件是：酶液/載體比11∶1（mL/mg），緩沖液pH 6.0，固定時間8 h和溫度35℃。經3次平行試驗，固定化酶活力平均值為27 980 U/g。

對游離酶和固定化酶部分酶學性質進行了比較，得出改性后固定化后酶的最適反應pH、溫度有所改變，最適pH=6.0，最適溫度為45℃，固定化酶儲存時間、操作穩定性和耐熱性比游離酶都更好。

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Modified Peanut Shells on α- Amylase Immobilized by Phosphoric Acid

LIAO Xiao-feng，YU Rong*，LIANG Hua-zheng，YAN Gen-hua
（East China Institute of Technology，Nanchang 330038，Jiangxi，China）

Abstract：A modified peanut shells as α-amylase immobilized on the enzymatic properties of the immobilized enzyme was detected，study the modified peanut shells fixed α-amylase adsorption optimal immobilization conditions and immobilized enzyme enzymatic properties. The results showed that：enzyme immobilization devel oped optimal conditions were：enzyme / carrier 11∶1（mL/mg）buffer pH6.0，8 h fixed time and Temperature 35℃. After three parallel experiments，the resulting immobilized enzyme actual average of 27 980 U/g. The free enzyme and immobilized enzymatic properties comparison，the immobilized enzyme modified optimum pH，temperature changes，as pH = 6.0，temperature was 45℃. At the same storage time，number of operations and the heat resistance was more than the free enzy.

Key words：modified peanut shells；immobilized enzyme；phosphoric acid

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.007

作者簡介：廖曉峰（1965—），男（漢），教授，碩導，博士，從事食品藥品分析。

*通信作者：于榮（1965—），女，高級實驗師，從事化學分析工作。

收稿日期：2015-03-15