用于細(xì)胞固定的微納SiO2基底研究

梁盛林， 周曉峰，車錄鋒

(1.中國(guó)科學(xué)院 上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 微系統(tǒng)技術(shù)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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用于細(xì)胞固定的微納SiO2基底研究

梁盛林1，2， 周曉峰1，車錄鋒1

(1.中國(guó)科學(xué)院 上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 微系統(tǒng)技術(shù)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

摘要:細(xì)胞陣列芯片在細(xì)胞生物學(xué)研究、藥物篩選等生物醫(yī)療領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。針對(duì)芯片上細(xì)胞固定時(shí)需要化學(xué)修飾的限制，提出了僅通過(guò)表面結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞固定的方案。基于MEMS技術(shù)，采用DRIE在硅片上得到超疏水的微納結(jié)構(gòu)，通過(guò)簡(jiǎn)單的高溫氧化工藝實(shí)現(xiàn)超親水性的SiO2結(jié)構(gòu)表面；再通過(guò)控制BOE腐蝕時(shí)間得到不同形貌的基底表面。計(jì)算了基底表面上的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的黏附效率，并在SEM下觀察了細(xì)胞與基底的相互作用行為，探討了粗糙表面影響細(xì)胞黏附的原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:采用DRIE和高溫氧化制備的微納SiO2基底表面能極大促進(jìn)細(xì)胞黏附，可應(yīng)用于細(xì)胞陣列芯片設(shè)計(jì)中。

關(guān)鍵詞:細(xì)胞陣列芯片； 微機(jī)電系統(tǒng)； 黏附； 細(xì)胞固定

0引言

細(xì)胞的體外分析是現(xiàn)代生命科學(xué)的一種研究手段，以微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)為基礎(chǔ)的細(xì)胞陣列芯片受到科研人員廣泛重視。通過(guò)微加工技術(shù)在基底上構(gòu)建微尺度的圖形結(jié)構(gòu)，并通過(guò)物理化學(xué)作用對(duì)表面進(jìn)行改性，使得細(xì)胞在特定區(qū)域?qū)崿F(xiàn)選擇性黏附，從而形成有序的細(xì)胞陣列[1]。在細(xì)胞陣列芯片上通過(guò)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的控制或者對(duì)黏附區(qū)域的特定設(shè)計(jì)，分析細(xì)胞的生長(zhǎng)行為變化及其相關(guān)成分的改變，可進(jìn)行對(duì)細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞間通信等生物學(xué)和基因組文庫(kù)篩選、藥物篩選等醫(yī)學(xué)研究[2～4]。與熒光分析手段和計(jì)算圖像處理技術(shù)相結(jié)合，二維平面的細(xì)胞陣列芯片具有便捷聚焦、高通量篩選和快速數(shù)據(jù)數(shù)理的優(yōu)點(diǎn)，提高了實(shí)驗(yàn)效率；同時(shí)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的小型化也有效降低了科研成本[5]。

在細(xì)胞陣列芯片中，如何將細(xì)胞有效固定在基底上是設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。常用的解決方法是對(duì)基底進(jìn)行特殊的修飾，一類是通過(guò)在芯片上不同區(qū)域覆蓋親水性能相異的化學(xué)成分，使細(xì)胞黏附于親水性強(qiáng)的地方[6]；另一類是在需要固著細(xì)胞的地方覆蓋各種生物分子，如多肽、DNA探針、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的親和力[7]。根據(jù)修飾成分的不同，需采用微接觸印刷、微流體法和光致聚合等制備方法[8,9]。

由于所修飾成分存在著不穩(wěn)定性，或所含物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的正常功能有著相應(yīng)影響，部分制備方法較為繁瑣，在細(xì)胞陣列設(shè)計(jì)上還存在著較大的改善空間。本文采用成熟的MEMS工藝，在硅基表面制備了超親水的微納SiO2柱陣列結(jié)構(gòu)，并且無(wú)需進(jìn)一步的化學(xué)成分和生物分子修飾，亦能極大提高細(xì)胞的黏附效率。再通過(guò)控制不同BOE腐蝕時(shí)間得到了不同表面形貌的結(jié)構(gòu)，分析了腐蝕時(shí)間對(duì)細(xì)胞黏附的影響。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1表面微納結(jié)構(gòu)的SiO2基底制備和接觸角測(cè)量

實(shí)驗(yàn)采用的硅片為直徑100 mm、〈100〉晶向的N型單面拋光片，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)清洗工藝處理后，用設(shè)備ALCATEL 601E進(jìn)行深反應(yīng)離子刻蝕，控制設(shè)備功率為90 W，SF6，C4F8和O2的流量分別為150，50，260 mL/min(標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)：101 325 Pa，0 ℃)。刻蝕15 min后，硅片在1 100 ℃的O2環(huán)境中氧化2 h。然后將硅片劃成10 mm×10 mm的方片，室溫(25 ℃)下分批在BOE溶液中分別處理60,120,180,240,300 s。再用去離子水沖洗3遍以除去殘留的反應(yīng)物，在75 ℃烘箱中烘干。在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察氧化前后的硅片和BOE腐蝕不同時(shí)間后的方片樣品的表面形貌。

為了表征不同成分和形貌的基底表面，采用視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)xEasyDrop進(jìn)行接觸角測(cè)量。用微液滴注射器將2μL的去離子水滴加到樣品表面，通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)對(duì)樣品上的液滴輪廓成像，觀察液滴在樣品表面的接觸行為。

1.2用于細(xì)胞在基底上培養(yǎng)的容器制備

容器材料選用生物相容性好的透明硅橡膠(美國(guó)SYLGARD)制作，以單體:固化劑=10︰1的比例配制聚二甲基硅氧烷(PDMS)，澆注到塑料培養(yǎng)皿上，厚度約為5 mm，在80 ℃熱板上加熱30 min進(jìn)行固化。冷卻后將PDMS從培養(yǎng)皿上釋放下來(lái)，分割成10 mm×10 mm的方塊，用方形空心不銹鋼管在方塊中心打孔，孔尺寸為6 mm×6 mm，隨后用無(wú)水乙醇和去離子水沖洗空心方塊以清除切割和打孔時(shí)殘留的碎削。再將空心PDMS方塊黏合于方片基底上，置于氧等離子表面處理儀中，表面處理30 s，以除去基底表面雜質(zhì)。

1.3細(xì)胞在不同基底上黏附效果分析

選用了人肺癌細(xì)胞(A549)和人肺腺癌細(xì)胞(H1975)作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，在含有10 %胎牛血清(美國(guó)Gibico)的RPMI—1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibico)中培養(yǎng)。用細(xì)胞膜綠色熒光探針DiO(中國(guó)碧云天)對(duì)細(xì)胞膜染色，離心清洗3遍后取適量在細(xì)胞培養(yǎng)基中吹打均勻，用血球計(jì)數(shù)板確定細(xì)胞濃度，再稀釋成約15個(gè)/μL。細(xì)胞培養(yǎng)容器在紫外光下滅菌處理 30 min，再往每個(gè)容器中加入稀釋后吹打均勻的細(xì)胞溶液120 μL，放入含5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)4 h。然后用移液槍吸掉培養(yǎng)容器中的細(xì)胞溶液，用PBS溶液輕輕漂洗基底3遍，加入4 %的多聚甲醛100 μL對(duì)基底的細(xì)胞固化15 min，再用PBS溶液漂洗2遍。將PDMS從方塊基底上揭去，基底在熒光顯微鏡(日本Nikon)下拍照，計(jì)算每片基底上熒光細(xì)胞的數(shù)量。

另取H1975細(xì)胞在不同基底上培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，經(jīng)PBS清洗2遍后，用2.5 %戊二醛在4 ℃下固定2 h，再用乙醇梯度脫水，真空干燥后噴金，在SEM下觀察基底表面細(xì)胞的形態(tài)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1微納SiO2表面的形態(tài)

DRIE工藝是SF6氣體對(duì)硅刻蝕和C4F8氣體對(duì)表面鈍化不斷重復(fù)的過(guò)程，通過(guò)合理設(shè)置各參數(shù)，使得在刻蝕周期里鈍化層沒(méi)有被完全轟擊掉，而是保留了零散分布的微納尺度的部分，在下一個(gè)刻蝕周期里成為了底部硅的保護(hù)層，刻蝕結(jié)束后在硅片表面生成了微納級(jí)的柱狀陣列結(jié)構(gòu)[10]。DRIE處理15 min 后硅表面的形貌如圖1(a)所示，柱陣列細(xì)而密集，柱子頂端尺寸范圍為200～1 000 nm。對(duì)其表面進(jìn)行潤(rùn)濕性分析發(fā)現(xiàn)呈超疏水性。而在高溫的O2環(huán)境中處理2 h后，變成SiO2柱陣列，如圖1(b)，(c)，表面形貌沒(méi)有太大的改變，但表面能則發(fā)生了極明顯的變化，接觸角已小于5°，呈現(xiàn)出超親水的特性。從截面圖上可以看到，基底上的SiO2柱陣列的高度達(dá)12 μm，整體上高度較為一致。且柱子側(cè)面呈波浪型的起伏，這為DRIE處理時(shí)刻蝕與鈍化的周期循環(huán)所致。

圖1　經(jīng)DRIE處理的硅片表面在氧化反應(yīng)前后的形貌和親水性Fig 1　Topography and wettability of silicon wafer processed by DRIE before/after oxidation

2.2細(xì)胞黏附效率與表面形貌的關(guān)系

由于此前2 h熱氧處理已經(jīng)使得表面柱陣列得到徹底氧化，而B(niǎo)OE溶液對(duì)SiO2有著較快的腐蝕速率，為了研究SiO2柱陣列的稀疏程度與細(xì)胞黏附的關(guān)系，對(duì)微納SiO2襯底片用BOE液進(jìn)行了處理，通過(guò)控制腐蝕時(shí)間來(lái)改變基底表面的形貌。再對(duì)沒(méi)有進(jìn)行BOE腐蝕和腐蝕后的基底進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，比較結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞黏附的影響。BOE腐蝕后的基底表面形貌和基底上面的部分熒光細(xì)胞如圖2所示。隨著在BOE溶液中處理時(shí)間的增加，基底表面的柱陣列頂端變得尖銳，同時(shí)柱的高度也逐漸下降；由于柱的寬度大小不一，因此，腐蝕時(shí)各自高度下降的速度也不一樣，整體變得參差不齊。腐蝕了240 s后，可以明顯看到了柱陣列的底部，說(shuō)明有些柱已經(jīng)被完全腐蝕掉。基底上熒光細(xì)胞的密度也出現(xiàn)了明顯的變化，隨著腐蝕時(shí)間的增加而逐漸下降。

圖2　經(jīng)BOE腐蝕不同時(shí)間后的基底SEM圖和A549細(xì)胞黏附熒光圖Fig 2　SEM images of substrates after different time of BOE and fluorescence micrographs of adherent of A549 cells

為了量化分析不同基底上細(xì)胞黏附情況，將熒光顯微鏡下基底上的細(xì)胞數(shù)量與剛開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)每個(gè)基底上放入的細(xì)胞量的比值定義為細(xì)胞的黏附效率，通過(guò)計(jì)算黏附效率比較基底對(duì)細(xì)胞的固定效果。A549細(xì)胞和H1975細(xì)胞的黏附效率與該基底在BOE溶液中處理時(shí)間的關(guān)系如圖3所示。由圖可見(jiàn)，在基底上兩種細(xì)胞的黏附效率都隨著基底BOE處理的時(shí)間的增加面下降。其中沒(méi)有進(jìn)行BOE處理的基底上A549細(xì)胞的黏附效率能達(dá)到84.6 %，H1975細(xì)胞則高達(dá)90.8 %，說(shuō)明此基底對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞黏附有著極強(qiáng)的促進(jìn)作用。而在腐蝕了300 s的基底上A549和H1975細(xì)胞的黏附效率只有26.0 %，54.5 %，有了大幅度的下降。將基底表面的形貌與相應(yīng)細(xì)胞黏附結(jié)果對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)，基底表面致密且高度整齊的SiO2柱陣列結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞黏附，而柱陣列的稀疏化和高度的不一致則會(huì)降低細(xì)胞的黏附效率。

圖3　A549和H1975細(xì)胞的黏附效率與基底BOE腐蝕時(shí)間的關(guān)系Fig 3　Relationship of adhesion efficiency of A549 and H1975 cell and BOE time of substrates

2.3細(xì)胞與基底的相互作用行為分析

基底表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞黏附行為的影響已有不少研究和結(jié)論，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)微納尺度的結(jié)構(gòu)有著敏感的反應(yīng)[11,12]。從微納SiO2基底上H1975細(xì)胞黏附的SEM圖(圖4)可以看到，細(xì)胞與基底的有效接觸部分是柱陣列的頂端。細(xì)胞會(huì)通過(guò)伸展偽足纏繞在其周圍的柱上，使得PBS溶液對(duì)基底進(jìn)行漂洗時(shí)細(xì)胞不容易從表面脫離，這是細(xì)胞在微納結(jié)構(gòu)表面上有較高黏附率的原因。而B(niǎo)OE溶液對(duì)SiO2的腐蝕令SiO2柱變得高低不一，細(xì)胞偽足能接觸的柱陣列變得少了，從而降低了細(xì)胞在基底上的黏附能力。基底受腐蝕的時(shí)間越長(zhǎng)，這種影響越明顯。

圖4　微納SiO2柱陣列上H1975細(xì)胞SEM圖Fig 4　SEM images of H1975 cells on micro-and nano-scale SiO2 pillar arrays

3結(jié)論

本文在單晶硅上采用DRIE技術(shù)，得到了微納尺度的硅柱陣列結(jié)構(gòu)，再通過(guò)高溫氧化實(shí)現(xiàn)了表面性能從超疏水到超親水的改變，并進(jìn)行BOE腐蝕實(shí)現(xiàn)了表面形貌的改變，通過(guò)SEM分析了腐蝕時(shí)間對(duì)表面形貌的影響。在不同基底上進(jìn)行了兩種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，分析了在相同培養(yǎng)時(shí)間后細(xì)胞黏附效率的差別，得到了整齊致密的SiO2柱陣列能促進(jìn)細(xì)胞黏附的結(jié)論。因此，可采用成熟的MEMS工藝，在硅片上特定區(qū)域進(jìn)行DRIE和氧化處理，而不必再進(jìn)行化學(xué)成分的修飾，就可以實(shí)現(xiàn)黏附型細(xì)胞在此區(qū)域的選擇性黏附，這與其他細(xì)胞陣列芯片相比，具有快速制備和工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，值得進(jìn)一步的分析研究。

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Research on micro-nano-scale SiO2substrate for cell immobilization

LIANG Sheng-lin1，2， ZHOU Xiao-feng1， CHE Lu-feng1

(1.Science and Technology on Microsystem Laboratory,Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200050,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

Abstract:Cell array chips have promising applications in biomedical field such as cell biology study and drug screening.To deal with the limitation of chemical modifications on chips for cell immobilization,a method with merely changing topography is carried out.Based on MEMS technology,superhydrophobic micro-nano-scale is formed on silicon wafer by DRIE and the surface turns superhydrophilic after thermal oxidation;surfaces with different topographies are fabricated by controlling the BOE etching time of SiO2.Circulating tumor cells adhesion efficiencies on substrates are calculated and interaction between cells and substrate is observed in SEM,then the reason of influence of rough surface on cell adhesion is discussed.Experimental results show that surface of SiO2 substrates at micro-and nano-scale fabricated by DRIE and thermal oxidation can greatly promote cell adhesion,which can be applied in cell array chip design.

Key words:cell array chip; MEMS; adhesion; cell immobilization

DOI:10.13873/J.1000—9787(2016)02—0058—03

收稿日期：2015—04—10

中圖分類號(hào):Q 819

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000—9787(2016)02—0058—03

作者簡(jiǎn)介:

梁盛林(1989-)，男，廣西玉林人，碩士研究生，主要從事微納系統(tǒng)的表面物理特性研究。

設(shè)計(jì)與制造