20(R)-人參皂苷Rg3對人乳腺癌細胞自噬作用的影響

陳凱云 何潔 梁文麗

20(R)-人參皂苷Rg3對人乳腺癌細胞自噬作用的影響

陳凱云 何潔 梁文麗

目的 觀察20(R)-人參皂苷Rg3對人乳腺癌細胞（MCF-7）自噬作用的影響，并探討20(R)-人參皂苷Rg3誘導MCF-7自噬作用的最佳劑量。方法 人乳腺癌細胞株分為20(R)-人參皂苷Rg3實驗組及空白對照組。采用MTT法觀察20(R)-人參皂苷Rg3對MCF-7細胞生長的抑制作用，并依據計算出的IC50值確定20(R)-人參皂苷Rg3的有效濃度。結果 當20(R)-人參皂苷Rg3濃度在37.5～600.0mg/L時，MCF-7細胞的生長抑制率最高，并隨其濃度的增加而增大，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。在熒光顯微鏡下觀察到細胞所含自噬泡明顯增多，說明20(R)-人參皂苷Rg3可誘導乳腺癌細胞自噬。蛋白質印跡法檢測結果顯示：LC3蛋白，特別是LC3-II的表達量與細胞自噬程度呈正相關，隨著20(R)-人參皂苷Rg3干預濃度的增大，LC3-I和LC3-II蛋白表達量亦明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 20(R)-人參皂苷Rg3能顯著抑制MCF-7細胞的增殖，且呈現良好的劑量、時間依賴性；20(R)-人參皂苷Rg3有誘導MCF-7細胞自噬作用。

20(R)-人參皂苷Rg3；人乳腺腫瘤細胞；細胞自噬

中藥人參中的四環三萜皂苷，又稱20(R)-人參皂苷Rg3。以往研究證實20(R)-人參皂苷Rg3具有抑制實驗動物體內移植腫瘤的生長、浸潤和轉移作用[1-3]，一些抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞增殖機制是通過誘導腫瘤細胞自噬活性來實現的[4-7]。20(R)-人參皂苷Rg3對人乳腺癌細胞（MCF-7）是否也具有同樣作用機制有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株（MCF-7）購于上海細胞研究所；20(R)-人參皂苷Rg3購于中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清購于杭州四季青生物工程公司；DMEM培養基、胰酶、胎牛血清（Hyclone公司，AQC23410）；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)液（華舜生物試劑公司）、3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine，3-MA)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于Sigma公司；抗LC3單抗（包括LC3-I和LC3-II）購自MBL CO.(Woburn，MA，USA，131220)。

1.2 方法

1.2.1 20(R)-人參皂苷Rg3溶液的制備 首先將20(R)-人參皂苷Rg3用DMSO溶解為100mg/mL濃度的溶液10mL，備用；使用前用含10%新生牛血清的DMEM培養液稀釋成實驗設計所需的濃度(37.5，75.0，150.0，300.0，600.0μg/mL)，DMSO終濃度＜0.1%。

1.2.2 人乳腺癌細胞（MCF-7）的培養 在人乳腺癌細胞（MCF-7）培養液中融入100μL青霉素、100μL鏈霉素后，將MCF-7細胞貼壁置于DMEM培養液中，要求在37℃、5% CO2的飽和濕度條件下培養[5]，生長至80%～90%融合后傳代，隔天換液1次。

1.2.3 MTT法測MCF-7細胞活性 觀察組取對數生長期的MCF-7細胞加入96孔板內，每孔200μL，常規培養24h后，加入稀釋后的20(R)-人參皂苷Rg3溶液，其終濃度分別為37.5，75.0，150.0，300.0及600.0mg/L；對照組加入含相應濃度乙二醇的10%新生牛血清DMEM培養液，繼續培養24h，48h，72h。向各孔內加入MTT溶液20μL(5mg/L)，37℃、5%CO2孵育4h，終止培養。小心吸棄孔內上清液100μL DMSO，震蕩10min，待沉淀完全溶解后用Bio-red550酶標儀測定490nm的吸光度值(A值)[5]；每組設3個平行孔，實驗重復進行3次，取平均值，對不同濃度20(R)-人參皂苷Rg3誘導后的MCF-7細胞生長抑制率進行計算。

通過細胞生長抑制率及藥物濃度作曲線求出IC50值。

細胞生長抑制率(%)=對照組細胞A值-加藥組細胞A值/對照組細胞A值×100%。

1.2.4 在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成 在轉染前12h將所需細胞經20（R）-人參皂苷Rg3處理

6d后的培養液，取1mL/L加入1μL MDC（50μmol/L）染液，37℃反應10min，去上清夜，PBS漂洗3次，用DAPI染色并封片。制作好的細胞切片以熒光顯微鏡觀察GFP-LC3熒光聚集情況并拍照。

1.2.5 自噬體膜上標志性蛋白質檢測 選擇傳代貼壁后細胞，加入DMEM高糖培養基（含10%CCFBS）培養48h，再分別加入含SPG-Rg3培養液，培養12h后吸出培養液，PBS洗2次，裂解細胞。將內容物移入離心管，離心15min(4℃，10000r/ min)。上清液置－20℃保存備用。用蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。定量取樣品蛋白50ug，電泳后移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h，棄溶液，每張膜分別加入兔抗ERKl／2、兔抗Phospho—ERKl／2、兔抗LC3B多克隆抗體、鼠抗GAPDH鼠單克隆抗體，4℃搖床12h，TBST洗膜3次，加辣根過氧化酶偶聯的羊抗兔IgG，TBST洗膜3次。在膜上加HRP和AP化學發光檢測底物，用熒光／化學發光成像系統成像分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件。計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 20(R)-人參皂苷Rg3對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響 結果表明，20(R)-人參皂苷Rg3作用后的不同時間階段（24，48，72h）后，20(R)-人參皂苷Rg3均能有效抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，其不同濃度與作用時間有依賴性。見表1。

表1 20(R)-人參皂苷Rg3對MCF-7細胞增殖的抑制作用(n=54)

2.2 GFP-LC3融合蛋白示蹤自噬形成 在熒光顯微鏡下觀察到，對照組高亮陽性細胞較少，細胞所含高亮顆粒也很少，而實驗組陽性細胞明顯增多，形成多個明亮的綠色熒光斑點，說明細胞所含自噬泡也明顯增多。說明20(R)-人參皂苷Rg3可誘導乳腺癌細胞自噬。見圖1A和1B。

2.3 20(R)-人參皂苷Rg3對人乳腺癌MCF-7細胞膜標記水平的影響 蛋白質印跡法檢測結果證實，與對照組比較，實驗組的MCF-7細胞中的LC3蛋白、LC3-II蛋白表達上調，有顯著性采用（P＜0.05），說明20(R)-人參皂苷Rg3可誘導乳腺癌細胞發生自噬，并且隨著20(R)-人參皂苷Rg3濃度的增大，MCF-7細胞中的LC3-I和LC3-II蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），并提示LC3蛋白，特別是LC3-II的表達量與細胞自噬程度呈正相關，即20(R)-人參皂苷Rg3能誘導MCF-7細胞自噬。見圖1C。

圖1 20(R)-人參皂苷Rg3與人乳腺癌MCF-7細胞的自噬體注：(A)在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成；(B)20(R)-20(R)-人參皂苷Rg3處理6d后觀察到的自噬體(黑箭頭)；(C)利用Western Blot法檢測自噬體膜上LC3-II/I比值的變大

3 討論

細胞自噬(autophagy)是一種程序化的細胞內降解過程，細胞通過溶酶體降解自身胞質成分實現細胞自身的代謝以及細胞器的更新，以維持細胞內環境穩態[1-3]。在腫瘤發生、發展的過程中，細胞自噬功能可防止有毒或致癌物質在胞內的累積，抑制細胞癌變。近年來一些抗腫瘤藥物通過誘導細胞自噬活性來抑制腫瘤細胞增殖的報道日益增多[4-9]。

研究結果證實，20(R)-人參皂苷Rg3能顯著抑制人乳腺癌細胞（MCF-7）的增殖，且呈現良好的劑量、時間依賴性。采用GFP-LC3融合蛋白示蹤細胞自噬形成，利用Western Blot法檢測自噬體膜上LC3-II/I比值的變化以此評價20(R)-人參皂苷Rg3誘導乳腺癌細胞MCF-7細胞自噬水平，本研究為20(R)-人參皂苷Rg3用于臨床乳腺癌治療打開新的思路。

[1] 陳迪，倪勁松，王心蕊，等.20(S)-20(R)-20(R)-人參皂苷Rg3對乳腺癌MCF-7細胞的誘導凋亡作用[J].吉林大學學報(醫學版)，2008，34(7)：610-614.

[2] 馬小俞，劉哲斌，喻三見，等.三苯氧胺誘導人乳腺耐藥及自噬的癌MCF-7細胞株關系研究[J].中國癌癥雜志，2011，21(6)：421-426.

[3] 陳莎，韓起，王旭輝，等.調節細胞對乳腺癌細胞紫杉醇耐藥性影響的實驗研究[J].時珍國醫國藥，2013，24(3)：516-520.

[4] 楊軒，袁棟棟，姜學軍，等.順鉑通過誘導膀胱癌細胞自噬促進細胞凋亡[J].北京大學學報（醫學版），2013，45(2)：221-226.

[5] 馬泰，孫國平，李家斌.細胞自噬的研究方法[J].生物化學與生物物理進展，2012，39（3）：204-209.

[6] 姚峰，王冠楠，魏文，等.硼替佐米和3-甲基腺嘌呤對有人乳腺癌細胞株MCF-7的抑瘤效應[J].微循環學雜志，2011，21（4）：7-9.

[7] 潘曉華，王墨林，崔行.20(R)-20(R)-人參皂苷Rg3對乳腺癌細胞增殖的影響及其機制探討[J].山東醫藥，2011，51（26）：20-22.

[8] 尹天翔，王燕燕.人參皂苷Rg3對人肝癌細胞增殖、遷移、黏附和凋亡的影響及其作用機制[J].基礎醫學與臨床，2015，35（3）：303-307.[9] 張龍月，陳瑩.人參皂苷Rg3對失巢凋記亡耐受乳腺癌細胞MCF-7抑制作用[J].中南藥學，2014，12(2)：128-131.

Objective To observe effect of autophagy of 20(R) - ginsenosides Rg3 on human breast cancer cell (MCF-7) and best dose of 20(R) -Rg3 ginsenosides induced MCF-7 autophagy function. Methods Human breast cancer cell lines was divided into experimental group of 20(R) -ginseng saponin Rg3 and the control group. Observe growth-inhibition of 20(R)-Rg3 ginsenosides on MCF-7 cell by MTT and according to the IC50 calculated determine the effective concentration of 20(R)-Rg3 ginsenosides. Results The MCF - 7 cell growth inhibition rate is highest and increases with the increasing of 20(R)-Rg3 ginsenosides concentration when the concentration of SPG-Rg3 was from 37.5 to 600.0mg/L.the cell growth was greatly inhibited compared with control group (P＜0.05).Increasing of cell autophagy bubble was observed under fluorescence microscope, which showed that 20(R)-Rg3 ginsenosides could induce autophagy breast cancer cells. Results showed that the expression of LC3 proteins, especially LC3-II was positively associated with the degree of cell autophagy, with 20(R) - ginseng saponin Rg3 intervention with the increasing of concentration and amount of LC3-I and LC3-II protein expression also increased significantly by protein imprinting method , there was difference compared with control group (P＜0.05). Conclusion 20(R)-Rg3 ginsenosides could inhibit the MCF-7 cell proliferation, and good dose and time relation of MCF-7 cell autophagy induced by 20(R)-Rg3 ginsenosides.

20(R)-Rg3 ginsenosides; Human breast tumor cells; Cell autophagy

江西 330003 南昌大學第四附屬醫院 （陳凱云 梁文麗）330000 南昌市第一醫院 （何潔）