異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚化合物的合成及其抗腫瘤活性

劉雄偉, 周　根, 姚　震, 王丹丹,劉歡歡, 鞏　藝, 劉雄利, 彭禮軍, 周　英

(貴州大學 藥學院 貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州 貴陽　550025)

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·研究論文·

異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚化合物的合成及其抗腫瘤活性

劉雄偉, 周根, 姚震, 王丹丹,劉歡歡, 鞏藝, 劉雄利*, 彭禮軍, 周英*

(貴州大學 藥學院 貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州 貴陽550025)

摘要：以取代靛紅,(E)-硝基異噁唑芳烯烴和苯基甘氨酸為原料，乙腈為溶劑，經1,3-偶極子3+2環加成反應合成了8個新型的異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚化合物(3a～3h)，產率41%～62%， d/r值為2 ∶1～10 ∶1，其結構經1H NMR,13C NMR和HR-ESI-MS表征。采用MTT法研究了3a～3h對人肺癌細胞(A549),人前列腺(PC-3)和人白血病細胞(K562)的體外抗腫瘤活性。結果表明：3a, 3b和3c分別對K562, PC-3和A549具有較好的抑制活性，其對應的IC50為16.0 μmol·L-1, 21.2 μmol·L-1和24.4 μmol·L-1，優于順鉑(26.1 μmol·L-1, 27.2 μmol·L-1和25.6 μmol·L-1)。

關鍵詞：異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚; 1,3-偶極環加成反應; 亞胺葉立德; 合成; 抗腫瘤活性

3-吡咯螺環氧化吲哚具有良好的生物活性，吸引了化學工作者的廣泛關注。如從煙曲霉發酵液中分離所得的Spirotryprostatins B，可阻斷細胞分裂的G2/M期，具有完全抑制tsFT210細胞的作用[1]。天然產物臺鉤藤堿被證明具有調節大腦皮層M受體亞型和5-羥色胺受體的功能[2]。從燈臺Muelleriana和多種Alstonisine仿生類似物中分離得到的天然生物堿Alstonisine，也具有較好的生理活性[3]。

異噁唑基團普遍存在于天然產物和藥物分子中。如Cloxacillin, Muscimol, Isoxicam和Leflunomide等[4-7]，在生物制藥領域有重要應用價值。

因此，將異噁唑基團拼接到3-吡咯螺環氧化吲哚骨架，合成一系列具備潛在活性的氧化吲哚衍生物，可為生物活性篩選提供來源。目前，尚無苯基甘氨酸與靛紅反應生成1,3-偶極子，再與硝基異噁唑烯烴發生1,3-偶極環加成反應，高效合成異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚化合物的報道。本文以取代靛紅(1a, 1d～1h),(E)-硝基異噁唑芳烯烴(2a～2c, 2h)和苯基甘氨酸為原料，乙腈為溶劑，經1,3-偶極子3+2環加成反應合成了8個新型的異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚化合物(3a～3h, Scheme 1)，產率41%～62%，d/r值為2 ∶1～10 ∶1，其結構經1H NMR,13C NMR和HR-ESI-MS表征。并采用MTT法研究了3a～3h對人肺癌細胞(A549),人前列腺(PC-3)和人白血病細胞(K562)的體外抗腫瘤活性。

Scheme 1

1實驗部分

1.1試劑與儀器

WRS-1B型熔點儀；Bruker 400 MHz型核磁共振儀(CD3Cl為溶劑，TMS為內標);MicroTMQ-TOF型高分辨質譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.23a～3h的合成(以3a為例)

在反應管中依次加入5-甲基靛紅(1a)64.4 mg(0.4 mmol)， (E)-硝基異噁唑對溴苯基烯烴(2a)184.8 mg(0.6 mmol)，苯基甘氨酸120.8 mg(0.8 mmol)和乙腈15 mL，攪拌下回流反應72 h。反應液經硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1]純化得3a 262.3 mg。

用類似的方法合成3b～3h。

3a: 蒼黃色固體;1H NMRδ: 2.22(s, 3H), 2.31(s, 3H), 4.94(d,J=8.1 Hz, 1H), 5.20(d,J=8.0 Hz, 1H), 5.80～5.85(m, 1H), 6.69(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 6.93～6.96(m, 2H), 7.20～7.27(m, 5H), 7.33～7.45(m, 3H), 7.91(s, 1H);13C NMRδ: 11.2, 20.9, 54.1, 55.3, 67.6, 69.5, 109.9, 125.5, 127.0, 127.1, 128.1, 128.2, 128.4, 129.6, 130.1, 131.5, 131.9, 132.3, 136.7, 139.3, 155.7, 171.7, 181.8; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C28H23N4O4BrNa{[M+Na]+}581.080 0, found 581.080 7。

3b: 淡黃色固體;1H NMRδ: 2.22(s, 3H), 2.29(s, 3H), 5.02(d,J=8.2 Hz, 1H), 5.24(d,J=7.9 Hz, 1H), 5.88～5.90(m, 1H), 6.69(d,J=4.2 Hz, 1H), 6.86(s, 1H), 6.94(d,J=4.2 Hz, 1H), 7.04～7.09(m, 1H), 7.19～7.26(m, 6H), 7.34～7.39(m, 3H), 8.10(s, 1H);13C NMRδ: 11.2, 20.9, 54.2, 55.8, 67.7, 69.6, 109.8, 125.4, 127.0, 127.8, 127.9, 128.1, 128.3, 128.4, 128.7, 155.6, 172.1, 182.0; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C28H24N4O4Na{[M+Na]+}503.169 5, found 503.169 9。

3c: 蒼黃色固體;1H NMRδ: 2.23(s, 3H), 2.46(s, 3H), 4.45(d,J=8.1 Hz, 1H), 4.93(d,J=7.9 Hz, 1H), 5.78～5.87(m, 2H), 6.62(d,J=7.6 Hz, 1H), 6.92～6.98(m, 1H), 7.02(d,J=7.4 Hz, 1H), 7.01～7.36(m, 5H), 7.41(d,J=5.1 Hz, 2H), 7.56(s, 1H), 7.63(s, 1H), 8.09(s, 1H);13C NMRδ: 11.3, 21.3, 45.6, 54.1, 61.7, 72.6, 109.8, 122.4, 124.5, 126.6, 127.0, 128.0, 128.1, 128.5, 128.7, 129.9, 130.2, 130.8, 131.0, 131.2, 131.4, 132.9, 136.0, 138.4, 140.7, 155.3, 172.4, 180.3; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C28H23N4O4BrNa{[M+Na]+}581.080 0, found 581.080 1。

3d: 黃色固體;1H NMRδ: 2.27(s, 3H), 2.49(s, 3H), 3.52(s, 3H), 4.92(d,J=7.8 Hz, 1H), 5.27～5.29(m, 1H), 5.89～5.90(m, 1H), 6.77～6.80(m, 1H), 6.91(d,J=4.5 Hz, 1H), 7.07～7.10(m, 2H), 7.19～7.25(m, 5H), 7.33(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.39～7.44(m, 2H), 7.64(s, 1H);13C NMRδ: 11.2, 18.7, 29.9, 54.8, 55.7, 61.7, 67.7, 119.9, 121.4, 122.3, 126.9, 127.1, 127.8, 128.1, 128.3, 128.5, 128.7, 133.4, 137.7, 139.7, 141.4, 155.6, 172.1, 180.8; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C29H26N4O4Na{[M+Na]+}517.185 1, found 517.185 1。

3e: 黃色固體;1H NMRδ: 2.15(s, 3H), 2.19(s, 3H), 3.10(s, 3H), 4.21(d,J=4.2 Hz, 1H), 4.75(d,J=8.2 Hz, 1H), 5.12～5.15(m, 1H), 6.78(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.95～6.97(m, 1H), 7.07～7.08(m, 1H), 7.19～7.29(m, 5H), 7.33～7.36(m, 3H), 7.40(d,J=4.5 Hz, 1H), 7.71(s, 1H);13C NMRδ: 10.7, 20.4, 26.1, 54.3, 55.1, 67.1, 69.1, 108.0, 124.9, 127.2, 128.0, 128.1, 128.7, 138.2, 140.3, 141.2, 155.7, 171.7, 179.4; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C29H26N4O4Na{[M+Na]+}517.185 1, found 517.185 0。

3f: 蒼黃色固體;1H NMRδ: 2.27(s, 3H), 4.39(d,J=4.3 Hz, 1H), 4.74(d,J=8.3 Hz, 1H), 5.04～5.07(m, 1H), 6.68(d,J=4.3 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 7.05～7.14(m, 1H), 7.23～7.30(m, 4H), 7.32～7.39(m, 4H), 7.50(s, 1H), 8.03(s, 1H);13C NMRδ: 10.8, 54.6, 67.0, 69.4, 72.2, 111.4, 112.8, 121.9, 127.2, 128.2, 131.0, 132.0, 139.6, 140.9, 141.6, 155.7, 171.3, 180.9; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C27H20N4O4Br2Na{[M+Na]+}644.974 9, found 644.974 5。

3g: 黃色固體;1H NMRδ: 2.22(s, 3H), 3.13(s, 3H), 4.34(d,J=4.1 Hz, 1H), 4.77(d,J=7.9 Hz, 1H), 5.07～5.10(m, 1H), 6.95(d,J=8.1 Hz, 1H), 7.05(s, 1H), 7.10～7.11(m, 1H), 7.19～7.22(m, 2H), 7.24～7.29(m, 3H), 7.31～7.34(m, 2H), 7.37(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.42(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.98(s, 1H);13C NMRδ: 11.3, 26.8, 54.7, 55.5, 67.7, 69.4, 110.4, 124.9, 126.6, 127.8, 128.5, 128.6, 129.2, 130.8, 138.3, 140.4, 143.0, 156.3, 171.6, 179.6; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C28H23N4O4ClNa{[M+Na]+}537.130 5, found 537.130 7。

3h: 黃色固體;1H NMRδ: 2.20(s, 3H), 3.15(s, 3H), 4.40(d,J=4.3 Hz, 1H), 4.66～4.73(m, 2H), 5.10～5.13(m, 1H), 6.88～6.94(m, 3H), 7.22～7.29(m, 4H), 7.31～7.33(m, 2H), 7.41(s, 1H), 7.58(d,J=7.9 Hz, 1H), 8.00(s, 1H);13C NMRδ: 10.9, 26.2, 50.1, 53.6, 67.6, 69.3, 108.5, 122.0, 124.1, 126.8, 127.8, 128.2, 128.3, 128.7, 129.6, 132.5, 134.7, 135.2, 139.5, 143.7, 155.7, 171.5, 179.5; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C28H22N4O4Cl2Na{[M+Na]+}571.091 5, found 571.091 4。

1.3體外抗腫瘤活性測定

采用MTT法[8-9]測試3a～3h對A549, PC-3及K562的體外抗腫瘤活性。以順鉑為陽性對照藥。

(1) 待測樣制作

用DMEM培養基[含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素]培養A549。以每孔4 000個細胞的濃度加入96孔中，在含5%CO2潮濕空氣的培養箱中于37 ℃培養24 h。

換用RPMI-1640培養基，細胞濃度為5 000個/孔，用類似的方法制作K562和PC-3待測樣。

(2) 細胞存活率測定

待測細胞孵育24 h后，在各孔中以梯度濃度加入新配3的二甲基亞砜溶液，使孔中3的最終濃度分別為5 μmol·L-1, 10 μmol·L-1, 20 μmol·L-1, 40 μmol·L-1和80 μmol·L-1。靜置48 h，每孔加入5 mg·mL-1MTT的磷酸鹽緩沖液10 μL，于37 ℃培養4 h。離心5 min，除去未轉化MTT，每孔中加入二甲基亞砜150 μL。用酶標儀測定波長490 nm處的OD值。IC50由spss軟件分析得到。

2結果與討論

2.1合成

通過底物擴展發現，該反應活性較低，反應72 h(TLC檢測)仍有部分1殘留。此外，當2苯環上為吸電子取代時[如氯原子取代(2h),溴原子取代(2a, 2c)]， 3產率有一定提高。其中3h產率最高(62%)。

2.2抗腫瘤活性

表1為3a～3h的體外抗腫瘤活性。由表1可見，3a～3h對A549, PC-3和K562均有較好的抑制活性。其中3a, 3b和3c分別對K562, PC-3和A549具有較好的抑制活性，其對應的IC50為16.0 μmol·L-1, 21.2 μmol·L-1和24.4 μmol·L-1，優于順鉑(26.1 μmol·L-1, 27.2 μmol·L-1和25.6 μmol·L-1)，說明3作為先導化合物，值得進一步研究。3的其他相關藥理活性的研究正在進行中。

表1　3a～3h的體外抗腫瘤活性

合成了8個新型的異噁唑拼接吡咯螺環氧化吲哚類化合物(3a～3h)。采用MTT法研究了3a～3h對人肺癌細胞(A549)，人前列腺(PC-3)和人白血病細胞(K562)的體外抗腫瘤活性。結果表明：3a, 3b和3c分別對K562, PC-3和A549抑制活性較好，其對應的IC50為16.0 μmol·L-1, 21.2 μmol·L-1和24.4 μmol·L-1，優于順鉑(26.1 μmol·L-1, 27.2 μmol·L-1和25.6 μmol·L-1)。其他相關藥理活性研究正在進行中。

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Synthesis and Antitumor Activities of Isoxazole-fused Spiropyrrolidine Oxindoles

LIU Xiong-wei,ZHOU Gen,YAO Zhen,WANG Dan-dan,LIU Huan-huan,GONG Yi,LIU Xiong-li*,PENG Li-jun,ZHOU Ying*

(Guizhou Engineering Center for Innovative Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine,College of Pharmacy,Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Abstract：Eight isoxazole-fused spiropyrrolidine oxindoles(3a～3h), in yields of 41%～62% with d/r of 2 ∶1～10 ∶1, were synthesized by 1,3-dipolar cycloaddition reaction, using N-substituted isatins, 3-methyl-4-nitro-5-alkenyl-isoxazoles and 2-phenylglycine as materials and MeCN as solvent. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-ESI-MS. The in vitro antitumor activities of 3a～3h against human prostate cancer cells(PC-3), human lung cancer cells(A549) and human leukemia cells(K562) were investgated by MTT method. The results demonstrated that 3a, 3b and 3c exhibited good inhibition activities against K562, PC-3 and A549 with IC50of 16.0 μmol·L-1, 21.2 μmol·L-1and 24.4 μmol·L-1, which were better than Cisplatin(26.1 μmol·L-1, 27.2 μmol·L-1and 25.6 μmol·L-1)。

Keywords：isoxazole-fused spiropyrrolidine oxindole; 1,3-dipolar cycloaddition reaction; azomethine ylide; synthesis; antitumor activity

收稿日期：2016-02-03

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目(21302024)； 國家自然科學地區基金資助項目(81560563)； 貴州省教學改革創新項目(SJJG201423)； 貴州省制藥工程專業學位研究生工作站[黔教研合JYSZ字(2014)002]

作者簡介：劉雄偉(1991-)，女，漢族，湖南婁底人，博士研究生，主要從事天然活性物質全合成及活性研究。 E-mail: 453184149@qq.com通信聯系人： 劉雄利，博士，副教授， E-mail: liuxiongli8302@163.com； 周英，博士，教授， E-mail: yingzhou71@yeah.net

中圖分類號：O626.13; O625.24

文獻標志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.05.16041