影響甘藍小孢子DH植株生長的幾個因素

劉　爭，張恩慧，程永安，許忠民，王改改

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌　712100)

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影響甘藍小孢子DH植株生長的幾個因素

劉爭，張恩慧，程永安，許忠民，王改改

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌712100)

摘要旨在篩選甘藍小孢子DH植株健壯生長的最適培養基和光照強度。為縮短小孢子DH植株培養時間并為獲得健壯植株創造條件，從而加快甘藍DH系育種進程。以甘藍‘秦甘50’為材料進行游離小孢子培養至誘導分化出不定芽，轉接到NAA質量濃度不同的2種培養基上(1/2MS+0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA和MS+0.1 mg/L NAA)，不同光照強度[40、60、80、100 μmol/(m2·s)]及添加不同質量濃度NH4NO3(0、0.4、0.8、1.2 g/L)培養，研究DH植株的生長勢，獲得甘藍小孢子DH植株最適培養基和培養條件。結果表明，在NAA質量濃度不同的培養基中，1/2MS +0.1 mg/L NAA培養基中小孢子DH植株生長速度最顯著，生根快、植株長勢強；在80 μmol/(m2·s)光照強度下培養小孢子DH植株凈生長高度顯著，10.3 d再生出根系,根質量較好，葉片大而厚；MS培養基中添加質量濃度為0.4 g/L的NH4NO3，小孢子DH植株生長健壯，35 d內植株凈生長高度最大為56.25 mm。以上結果說明，甘藍小孢子DH植株快速健壯生長的適宜培養基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖；在80 μmol/(m2·s)光照強度下或MS培養基中添加質量濃度為0.4 g/L的NH4NO3均能夠促進甘藍小孢子DH植株根莖葉生長旺盛。

關鍵詞甘藍；DH植株；小孢子再生；培養基；光照強度；NH4NO3

結球甘藍(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)為十字花科蕓薹屬蔬菜，原產于地中海沿岸，是世界各國特別是歐美國家喜食的重要蔬菜作物，現在世界各地廣泛栽培[1]。甘藍具有顯著的雜種優勢，雜種一代是由性狀純合的2個親本雜交而成。純合親本的獲得除多代自交外，游離小孢子培養也是創制純合自交系的快速途徑[2-3]。甘藍游離小孢子培養(Isolated microspore culture)是指從甘藍的花蕾中直接分離獲得游離態、新鮮、發育時期合適的小孢子群體，通過培養使其脫分化，經由胚狀體或愈傷組織誘導，再生獲得單倍體(Haploid)植株，而后經過自發或誘發的染色體加倍成為正常可育、高度純合的雙單倍體(Double Haploid，簡稱DH)植株的過程，這種雙單倍體植株的自交后代則是DH系。DH系遺傳基因純合、性狀穩定，可以直接作為親本材料應用于雜種一代品種的選配[4-6]。近年來，甘藍游離小孢子培養技術體系已初步建立，研究取得一定進展[7-11]，但這項技術在甘藍上的應用還不夠理想，主要表現在小孢子誘導的胚狀體成苗率低、質量差、耗時長，苗體生長發育速度緩慢等問題，直接影響小孢子DH植株健壯生長，導致當年培養的DH株田間移栽過晚，或越冬前DH株的營養體過小，最終導致小孢子DH植株春化不徹底，翌年DH株不能正常抽薹開花，延長利用DH系育種的年限。因而，探究甘藍游離小孢子培養中影響小孢子DH植株健壯生長的栽培因素就顯得尤為重要，尋找最適的胚狀體再生植株培養基和適宜植株生長的光照強度，旨在為縮短小孢子再生植株培養時間和獲得健壯植株苗創造條件，從而加快甘藍DH系育種進程。

1材料與方法

1.1試驗材料

甘藍‘秦甘50’供試材料由西北農林科技大學園藝學院甘藍育種室提供。甘藍‘秦甘50’為雜種一代，2013-07-25露地播種育苗，6～7片真葉定植，2013-11-28假植窖藏越冬，2014-03-08定植紗網棚，正常管理；當植株抽薹時，選取合適花蕾進行游離小孢子培養，出胚后將發育正常、生長健壯的子葉型胚狀體轉接到B5+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L + Suc 30 g/L + Agar 9 g/L培養基上，在溫度為23～25 ℃，光照強度為25～30 μmol/(m2·s)、光照時間14 h/d的條件下培養，直至分化出不定芽。

1.2試驗方法

1.2.1培養基與NAA質量濃度對小孢子DH植株長勢的影響選取高度相同的不定芽自基部切下，轉接到含0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖的1/2MS(有機物質質量濃度不變，其余物質質量濃度減半)培養基和0.1 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖的MS培養基，在25 ℃、光照強度為60 μmol/(m2·s)、光照時間為14 h/d條件下培養，比較含有不同質量濃度NAA的1/2MS和MS培養基對小孢子DH植株生長勢的影響。

1.2.2光照強度對小孢子DH植株長勢的影響選取高度相同的不定芽自基部切下，轉接到MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L 瓊脂+30 g/L蔗糖的培養基上，在25 ℃、光照時間為14 h/d、光照強度分別為40、60、80、100 μmol/(m2·s)條件下培養，比較不同光照強度對小孢子DH植株生長勢的影響。

1.2.3MS培養基添加NH4NO3對小孢子DH植株長勢的影響選取高度相同的不定芽自基部切下，轉接到質量濃度為0、0.4、0.8、1.2 g/L NH4NO3的MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L 瓊脂+30 g/L蔗糖的培養基上，在25 ℃、光照強度為60 μmol/(m2·s)、光照時間為14 h/d條件下培養，比較NH4NO3對小孢子DH植株生長勢的影響。

以上處理中，口徑3 cm的指形培養試管中轉接1個不定芽，每個處理轉接15個不定芽，重復3次；處理后定期觀察統計植株高度、葉片和根系的生長發育，田間移栽時測植株質量。

1.3數據分析

采用DPS7.05 Duncan’s新復極差法分析，Excel作圖。

2結果與分析

2.1培養基與NAA質量濃度對小孢子DH植株生長勢的影響

從表1和圖1看出，MS培養基中不同營養成分和NAA質量濃度對小孢子DH植株生長具有較大的影響， A2和A3處理有利于小孢子DH植株健壯生長，其胚狀體不定芽轉接培養小孢子再生植株后，間隔7 d植株凈生長高度[12]值統計分析，A2和A3的小孢子DH植株凈生長高度始終高于其他處理，35 d時觀察小孢子DH植株長勢，A2和A3植株生長健壯，葉片鮮綠、面積大，根系數量多、粗壯，移栽時苗質量分別達2.56、2.20 g(圖2)，與其他處理比較，小孢子DH植株生長勢存在顯著性差異，差異值主要表現在不定芽轉接后培養的28 d內。A4和A5處理小孢子DH植株生長勢次之，A1處理小孢子DH植株生長勢最弱。處理A2、A3和A4在28 d內植株高度持續增長，但28 ～35 d的植株高度變化不大，而處理A1和A5在35 d內植株高度持續增長。由此得出，1/2MS+0.1 mg/L或0.2 mg/L NAA+8 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖培養基適宜甘藍小孢子DH植株健壯生長。

表1　不同培養基與NAA質量濃度下小孢子DH植株生長結果

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數據后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，數據以“平均數±標準差”表示。下同。

Note：Different lowercase in each column indicate significant difference atP<0.05 and different uppercase letters indicate extremely significant difference atP<0.01, the data expressed in “Average±Standard Deviation”.The same below.

圖1　不同培養基與NAA質量濃度下植株的生長高度

2.2光照強度對小孢子DH植株生長勢的影響

A.1/2MS+0.1 mg/L NAA培養基中植株形態Plant morphology in 1/2MS+0.1 mg/L NAA culture medium；B. 1/2MS+0.2 mg/L NAA培養基植株形態Plant morphology in 1/2MS+0.2 mg/L NAA culture medium

圖21/2MS+0.1 mg/L和0.2 mg/L NAA培養基中培養35d后甘藍小孢子再生植株形態

從表2和圖3看出，適宜的光照強度能夠促進小孢子DH植株健壯生長，不同光照強度處理中，80 μmol/(m2·s)的小孢子DH植株生長旺盛，葉片大而厚，間隔7 d植株凈生長高度與其他處理存在顯著性差異，其植株凈生長高度最大，60 μmol/(m2·s)下的次之，40和100 μmol/(m2·s)下的較小。小孢子DH植株初生根時間隨著光照強度的增加而減短，植株根系健壯程度在一定光照強度范圍內隨著光照強度的增加而增強；在80 μmol/(m2·s)下植株根系生長最健壯，表現根多且粗(圖4-C)；60 μmol/(m2·s)下植株根系生長健壯程度次之(圖4-B)，表現根多較細；40 μmol/(m2·s)和100 μmol/(m2·s)下植株根系數量較少且粗細不一致(圖4-A、D)。光照4個處理在35 d內小孢子DH植株高度值持續增加。由此得出，將甘藍胚狀體不定芽轉接后，放置在80 μmol/(m2·s)的光照強度下培養有利于小孢子DH植株快速健壯生長。

Fig.2　Plant morphology in 1/2MS+ 0.1 mg/L and 0.2 mg/L NAA medium cultured for 35 d

圖3　不同光照強度下植株的生長高度

2.3MS培養基添加附加物NH4NO3對小孢子DH植株長勢的影響

從表3和圖5可看出，MS培養基中添加適量的NH4NO3能夠促進小孢子DH植株快速、健壯生長，在添加不同質量濃度NH4NO3處理中，轉接后7、14 d各處理間植株凈生長高度差異不顯著，14 d后N1 處理的小孢子DH植株凈生長高度間隔7 d分別增加37.40、47.93和56.25 mm，與其他處理存在顯著性差異；由小孢子DH植株長勢相比較， N1處理的植株生長健壯，葉片大、葉柄長，初生根系時間為7.5 d，根系粗壯，移栽苗質量達到2.80 g；N2處理和 N0處理植株生A．光照強度40 μmol/(m2·s) The illumination is 40 μmol/(m2·s)； B．光照強度60 μmol/(m2·s)The illumination is 60 μmol/(m2·s)； C．光照強度80 μmol/(m2·s)The illumination is 80 μmol/(m2·s)； D.光照強度100 μmol/(m2·s) The illumination is 100 μmol/(m2·s)

圖4　不同光照強度下培養35 d 后植株形態

圖5　MS培養基中添加NH4NO3甘藍小孢子DH植株生長的結果

長勢次之，表現出莖葉或根系單一生長健壯； N3處理生長勢最差。由此得出，利用MS培養基再生甘藍小孢子植株時添加0.4 g/L NH4NO3能夠促進植株快速健壯生長。

3討 論

植物地上部分生長與地下部分生長具有相關性，地下部分生長促進地上部分生長，地上部分發育有利于地下部分發育；大量有機物質和礦物質供給才能保障植株地上部分莖葉和地下部分根系快速健壯生長，但不同種類植物的生長對營養物質的種類和需求量是有選擇的，尤其在植物組織培養中，培養基的成分對再生植株生長影響較大。本研究結果表明，有機物含量不變、其余物質含量減半的1/2MS培養基比MS培養基在28 d苗齡段內更顯著的促進甘藍小孢子DH植株快速健壯生長，表明，甘藍小孢子組織培養苗生長對有機物質需要量相對較大，而對礦物質需求量相對較少；但苗齡超過28 d的繼續培養會因1/2MS培養基中營養物質含量過少而生長減緩，需要及時繼代或煉苗移栽。植物激素α-萘乙酸(NAA)具有促進根系再生的功能，但在培養基中額外添加過多NAA反而不利或抑制根系生長，對根系再生能力較強的甘藍而言，其生長過程中能分泌出一定量刺激生根的內源激素，因而在組培時未添加NAA時外植體也可緩慢生根。本研究結果也驗證這一結論，結果表明，在1/2MS培養基中添加0.1和0.2 mg/L NAA能夠促進甘藍小孢子植株健壯生長，但超過0.2 mg/L NAA易導致小孢子DH植株根系長勢弱，植株生長緩慢。

光照強度是影響組培苗光合作用和生長的外在因素，適度提高光照強度可使甘藍小孢子DH植株更好地生長發育。尹明華等[13]研究認為，高光照強度對紅芽芋試管苗的生長發育影響較大，高光照度4 500 lx處理的試管苗新生芽數、新生根數、新生根長和株高均顯著高于低光照度處理。王政等[14]研究得出，光照強度變幅為45～81 μmol/(m2·s)時，隨著光照強度增加對彩色馬蹄蓮試管苗的生長有明顯的促進作用。本研究中光照強度為80 μmol/(m2·s)時，小孢子DH植株凈生長高度較其他光照強度處理顯著提高，小孢子DH植株的生根速度較快，根的質量較好，植株生長發育良好；過低的光照強度使小孢子DH植株得不到足夠的光照，或過高的光照強度可能抑制光合作用，兩者均引起光合產物降低。本試驗中光照強度為40或100 μmol/(m2·s)時，可能因光照強度較弱或過強均不利于小孢子DH植株光合作用，從而導致植株長勢較弱。

參考文獻Reference：

[1]李曉明,李曉紅,馮輝.結球甘藍的雜種優勢利用進展[J].遼寧農業科學,2004(5):31-34.

LI X M,LI X H,FENG H.Development on heterosis utilization of the cabbage[J].LiaoningAgriculturalSciences,2004(5):31-34(in Chinese).

[2]嚴準,田志宏,孟金陵.甘藍游離小孢子培養的初步研究[J].華中農業大學學報,1999,18(1):10-12.

YAN ZH,TIAN ZH H,MENG J L.Primary study on isolated microspore culture of cabbage(BrassicaoleraceaL.)[J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,1999,18(1):10-12(in Chinese).

[3]袁素霞,劉玉梅,方智遠,等.結球甘藍和青花菜小孢子胚植株再生[J].植物學報,2010,45(2):226-232.

YUAN S X,LIU Y M,FANG ZH Y,etal.Plant regeneration from microspore-derived embryos in cabbage (BrassicaoleraceaL.var.capitataL.) and broccoli (BrassicaoleraceaL.var.italicPlanch.) [J].ChineseBulletinofBotany,2010,45(2):226-232(in Chinese with English abstract).

[4]LICHTER R.Induction of haploid plants from isolated pollen ofBrassicanapus[J].ZeitischriftFürPflanzenphysiologic,1982,105(5):427-434.

[5]TAKAHATA Y,KELLER W A.High frequency embryogenesis from microspore culture ofBrassicaoleracea[J].PlantBreeding,1990,40(1):134-135.

[6]楊麗梅,方智遠,劉玉梅,等.利用小孢子培養選育甘藍自交系[J].中國蔬菜,2003(6):36-37.

YANG L M,FANG ZH Y,LIU Y M,etal.Breeding inbred lines of cabbage with isolated microspore culture [J].ChinaVegetables,2003(6):36-37(in Chinese).

[7]張恩慧,程芳芳,楊安平,等.株齡、栽培環境及溫度對甘藍小孢子誘導出胚的影響[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2014,42(1):120-124.

ZHANG E H,CHENG F F,YANG A P,etal.Influence of plant age,cultivation environment and temperature on cabbage embryo induction by isolated microspore culture[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2014,42(1):120-124(in Chinese with English abstract).

[8]方淑桂,陳文輝,曾小玲,等.結球甘藍游離小孢子培養及植株再生[J].園藝學報,2006,33(1):158-160.

FANG SH G,CHEN W H,ZENG X L,etal.Isolated microspore culture and plantlet regeneration in cabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.) [J].ActaHorticulturaeSinica,2006,33(1):158-160(in Chinese with English abstract).

[9]姜鳳英,馮輝,李娜,等.甘藍類植物游離小孢子培養研究進展[J].遼寧農業科學,2006(5):28-30.

JIANG F Y,FENG H,LI N,etal.Research advance on isolated microspore culture in cabbage vegetable[J].LiaoningagriculturalSciences,2006(5):28-30(in Chinese).

[10]曾愛松,馮翠,高兵,等.結球甘藍小孢子培養技術體系的優化研究[J].華北農學報,2010,25(增刊):40-44.

ZENG A S,FENG C,GAO B,etal.The optimization study of isolated microspore culture system in cabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.) [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2010,25(supplement):40-44(in Chinese with English abstract).

[11]楊安平,張恩慧,王莎莎,等.甘藍類蔬菜小孢子培養研究進展[J].中國農學通報,2008,24(7):332-335.

YANG A P,ZHANG E H,WANG SH SH,etal.The advances of studies on microspore culture in cabbage vegetables [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2008,24(7):332-335(in Chinese with English abstract).

[12]劉瑩瑩,張恩慧,許忠民,等.甘藍小孢子胚狀體分化不定芽再生植株的研究[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2013,41(8):149-154.

LIU Y Y,ZHANG E H,XU ZH M,etal.Adventitious bud regeneration plant differentiation from cabbage microspore embryoid[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2013,41(8):149-154(in Chinese with English abstract).

[13]尹明華,王艾平.光照時間和光照強度對紅芽芋試管苗生長發育的影響[J].貴州農業科學,2013,41(9):63-65.

YIN M H,WANG A P.Effects of light duration and intensity on the growth of red bud taro plantlets[J].GuizhouAgriculturalSciences,2013,41(9):63-65(in Chinese with English abstract).

[14]王政,郭玉珍,何松林.不同光照強度對彩色馬蹄蓮試管苗生長的影響[J].西北林學院學報,2011,26(3):84-87.

WANG ZH,GUO Y ZH,HE S L.Effects of illumination on the growth of coloredZantedeschiashoots in virto[J].JournalofNorthwestForestryUniversity,2011,26(3):84-87 (in Chinese with English abstract).

[15]買凱樂,韓富亮,董麗芬,等.N、P、K元素對油松試管苗生長及生根誘導的影響[J].西北林學院學報,2007,22(5):69-71,139.

MAI K L,HAN F L,DONG L F,etal.The effect of nitrogen phosphorus and potassium elements on growth and root induction of test tube seedlings of Chinese pine[J].JournalofNorthwestForestryUniversity,2007,22(5):69-71,139(in Chinese with English abstract).

[16]萬學鋒,賴鐘雄,陳菁瑛.不同培養基質對麥冬離體培養的影響[J].福建農業學報,2013,28(7):670-674.

WAN X F,LAI ZH X,CHEN J Y.Effects of different culture medium onOphiopogonjaponicus(L.F) Kew-Gawl.in vitro culture[J].FujianJournalofAgriculturalSciences,2013,28(7):670-674(in Chinese with English abstract).

[17]張春華,樸炫春,廉美蘭,等.培養基組成對滿天星試管苗增殖的影響[J].延邊大學農學學報,2005,27(1):35-39.

ZHANG CH H,PIAO X CH,LIAN M L,etal.Effect of medium composition on the proliferation ofGypsophilapaniculataL.in vitro[J].JournalofAgriculturalScienceYanbianUniversity,2005,27(1):35-39(in Chinese with English abstract).

[18]牛振明,張國斌,劉趙帆,等.氮素形態及配比對甘藍養分吸收、產量以及品質的影響[J].草業學報,2013,22(6):68-76.

NIU ZH M,ZHANG G B,LIU ZH F,etal.Effects of different nitrogen forms on nutrient uptake,yield formation and quality of cabbage[J].ActaPrataculturaeSinica,2013,22(6):68-76(in Chinese with English abstract).

Received 2015-10-08Returned2015-11-19

Foundation itemThe National Key Technology Support Program(No.2012BAD02B01); Technical System Project of National Bulk Vegetable Industry(No.CARS-25); Science and Technology Innovation Project of Shaanxi Province(No.2012NKC02-05).

First authorLIU Zheng, male, master student.Research area: cabbage breeding and biotechnology.E-mail:liuzhenglxy@163.com

(責任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Influence of Several Factors on Growth of DH Plants Regenerated from Microspores in Cabbage

LIU Zheng, ZHANG Enhui, CHENG Yong’an, XU Zhongmin and WANG Gaigai

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

AbstractAims to screen the most appropriate medium and illumination for DH plants regenerated from microspore in cabbage and to shorten culture time of obtaining robust plants, which will accelerate the breeding process of cabbage double haploid. Microspores of ‘Qin-gan 50’ cabbage was cultured until emergence of adventitious buds which then transferred to two kinds of mediums (1/2MS+0,0.1,0.2,0.3 mg/L NAA and MS+0.1 mg/L NAA), adding different amount of NH4NO3(0,0.4,0.8,1.2 g/L) in MS medium and cultured at different illumination [40,60,80,100 μmol/(m2·s)] . Then the growth vigor of the DH plants were studied and the most appropriate medium and culture conditions could be gotten. The DH plants grown in 1/2MS +0.1 mg/L NAA medium had the fastest growth rate and strong growth vigor, rooting fast;cultured in the illumination of 80 μmol/(m2·s),the DH plants had the most remarkable growth speed, better roots and leaves, which rooted in 10.3 days;the DH plants in MS medium with added 0.4 g/L NH4NO3 had the maximum value 56.25 mm of net growth height in 35 days. In conclusion, the appropriate medium for the DH plants regenerated from microspore in cabbage is 1/2MS+0.1 mg/L NAA+8 g/L Agar+30 g/L Sugar;cultured in the illumination of 80 μmol/(m2·s) or transferred into the MS medium with added 0.4 g/L NH4NO3, the DH plants grown well with robust roots, stems and leaves.

Key wordsCabbage; DH plants; Regeneration from microspores; Medium; Illumination; NH4NO3

收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-11-19

基金項目：國家科技支撐計劃(2012BAD02B01)；國家大宗蔬菜產業技術體系(CARS-25)；陜西省科技創新(2012NKC02-05)。

通信作者：張恩慧，男，教授，碩士生導師，研究方向為甘藍育種與生物技術。E-mail：ganlan606@126.com

中圖分類號S635.1

文獻標志碼A

文章編號1004-1389(2016)04-0605-07

Corresponding authorZHANG Enhui,male,professor,master supervisor.Research area:cabbage breeding and biotechnology.E-mail:ganlan606@126.com

網絡出版日期：2016-04-02

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160402.1118.034.html

第一作者：劉爭，男，碩士研究生，研究方向為甘藍育種與生物技術。E-mail：liuzhenglxy@163.com